電針預(yù)處理對抑郁模型大鼠電休克治療后認知功能及腺苷酸活化蛋白激酶信號通路的影響

米智華,高 巨

(揚州大學臨床醫(yī)學院 江蘇省蘇北人民醫(yī)院 麻醉科,江蘇 揚州,225001)

抑郁癥又稱抑郁障礙(DD),是臨床上常見的情感性精神障礙(AD),主要表現(xiàn)為認知功能損害和軀體癥狀，以心境低落、思維遲緩、意志活動減退為主要特征[1]。電休克治療(ECT)是目前公認的治療重度抑郁癥(MDD)最為有效的治療手段，具有效率高、起效快等特點，但ECT治療可導(dǎo)致患者學習記憶功能損害[2-3]。針刺是中國傳統(tǒng)醫(yī)學的瑰寶，在緩解抑郁癥狀方面具有獨特的功效。動物實驗[4]證實，電針在減輕腦損傷、改善學習記憶功能等方面，具有顯著的效果。電針預(yù)處理可激活腦缺血再灌注損傷模型小鼠的AMPK信號通路，減輕海馬神經(jīng)元凋亡。在POCD大鼠模型中，電針預(yù)處理也可通過上調(diào)海馬腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號通路，改善大鼠術(shù)后認知功能障礙[5]。迄今為止，未見將電針應(yīng)用于抑郁電休克治療的報道。本實驗擬通過電針預(yù)處理，觀察其對抑郁模型大鼠電休克治療后學習記憶能力的影響，并探討AMPK信號通路的作用，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠，體質(zhì)量為180～220 g,購于揚州大學比較醫(yī)學中心。飼養(yǎng)環(huán)境:飼養(yǎng)環(huán)境要保持安靜，室溫(25.00±2.00)℃,濕度(55.00±10.00)%,大鼠可自由攝食飲水，養(yǎng)成固定的晝夜節(jié)律(12 h/12 h)。本實驗通過揚州大學實驗動物倫理審核。實驗開始前，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 實驗分組

采用Open-field評分法將水平運動次數(shù)加垂直運動次數(shù)低于40次或大于100次的大鼠剔除，選擇相近的75只大鼠，按照隨機數(shù)字表法分為正常對照組(Ⅰ組)、模型組(Ⅱ組)、電休克組(Ⅲ組)、電針+電休克組(Ⅳ組)、Sham+電休克組(Ⅴ組)，每組15只。

1.3 模型建立

正常對照組每籠5只正常飼養(yǎng)，不做其他實驗干預(yù)。其余4組參照《神經(jīng)生物學實用實驗技術(shù)》[6]介紹的方法，選擇其中7種刺激模式造模，包括禁水禁食(24 h)、冰水游泳(4 ℃,5 min)、傾斜鼠籠(45°)、晝夜顛倒(24 h)、潮濕墊料(24 h)、夾尾(1 min)、水平震蕩(5 min),每天隨機安排1種刺激方式，每種刺激在實驗全程中使用3次。連續(xù)干預(yù)21 d。

1.4 干預(yù)措施

1.4.1 麻醉方法:采用腹腔注射異丙酚(北京費森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司，國藥準字J20160089)100 mg/kg進行麻醉，給藥2 min后大鼠出現(xiàn)翻正反應(yīng)消失，即達到麻醉效果。

1.4.2 電針預(yù)處理:麻醉成功后，將大鼠四肢固定在實驗操作臺上，采用15.00 mm×0.26 mm針灸針針刺穴位。參照《常用動物腧穴圖譜》[7]進行取穴。選取百會穴、印堂穴(見圖1)。百會穴向前沿皮刺入2 mm,印堂穴針尖向下沿皮刺2 mm,接華佗牌SDZ-Ⅱ型電針儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)。調(diào)節(jié)刺激參數(shù):疏密波，頻率2 Hz/10 Hz,電流強度1 mA,大鼠胡須輕微抖動視為電針刺激有效的標志，持續(xù)30 min。Ⅰ～Ⅲ組不進行電針干預(yù)。Ⅳ組在ECT治療前30 min,先行電針刺百會穴、印堂穴，疏密波，強度1 mA,頻率2 Hz/15 Hz。Ⅴ組在ECT治療前30 min,先進行非穴位(百會穴、印堂穴旁開5 mm)電針刺激，操作方法及參數(shù)設(shè)置同Ⅳ組。

(a.側(cè)面觀;b.正面觀)

圖1 大鼠穴位示意圖

1.4.3 電休克治療:電針干預(yù)結(jié)束后，按組別進行電休克。Ⅱ組僅進行麻醉，不行ECT治療;Ⅲ～Ⅴ組進行ECT治療。采用改良電休克治療儀(Niviqure公司，印度)進行電刺激。大鼠雙耳連接電極，調(diào)整治療參數(shù)為雙向矩形波，電量120 mC,頻率125 Hz,放電時間1 s,波幅0.8 A,波寬1.5 ms,電阻500～1 500 Ω。按下放電按鈕，大鼠出現(xiàn)強直-陣攣-肌肉松弛表現(xiàn),1次/d,連續(xù)6 d。

1.5 評價指標

1.5.1 Morris水迷宮:Morris水迷宮由1個圓柱形水池(直徑1.2 m,高0.5 m)和圖像采集分析系統(tǒng)組成。實驗過程中，保持水溫22～24 ℃,水深0.3 m。將水池平均劃分為A、B、C、D共4個象限，每個象限的中點作為入水點。在D象限的中央放置圓柱形透明平臺(直徑10.0 cm,高29.0 cm)。在水迷宮的上方安置攝像系統(tǒng)，實時記錄大鼠的運動軌跡。在訓練期間，保持迷宮內(nèi)外環(huán)境恒定不變[8]。適應(yīng)性飼養(yǎng)大鼠7 d后，開始實驗(作為實驗第1天)。分別于實驗的第1天(造模前第6天)、第28天(造模成功后第1天)和第40天(ECT結(jié)束后第1天)進行Morris水迷宮實驗，包括定位航行實驗和空間探索實驗。

定位航行實驗主要用于評估大鼠的學習記憶功能。每天在相同的時間段進行實驗。每次實驗的第1～4天進行大鼠游泳訓練，第5天記錄其定位航行時間。訓練開始時，將平臺置于D象限。訓練前將大鼠先放在平臺上適應(yīng)30 s,再將大鼠從池壁任意一個起始點面向池壁放入。攝像系統(tǒng)追蹤記錄大鼠尋找平臺的時間(即逃避潛伏期)和游泳路徑，拍攝并連接路徑追蹤系統(tǒng)進行采集。每次游泳時限為100 s,在100 s內(nèi)未找到平臺者系統(tǒng)自動停止記錄(逃避潛伏期記為100 s)。將大鼠引導(dǎo)至平臺上，休息30 s后進行下一次試驗。在實驗第5天(造模前第2天)、第32天(造模成功后第5天)、第44天(ECT治療結(jié)束后第5天)，將大鼠從每一象限連續(xù)2次放入水池，記錄其尋找平臺的平均時間作為其逃避潛伏期，并記錄其游泳路徑[9]。

空間探索實驗主要用于觀察大鼠的空間記憶能力。在實驗的第6天(造模前1天)、第33天(ECT治療前1天)、第45天(ECT治療結(jié)束后第6天)，撤除原平臺，將大鼠從任意1個象限的入水點面向水池壁放入水池中(所有大鼠均從同一位置入水)。記錄100 s內(nèi)大鼠穿越原平臺區(qū)域的次數(shù)[10]。

1.5.2 AMPK與磷酸化AMPK(p-AMPK)表達的測定:于實驗第6天(造模前1 d)、實驗第33天(造模成功后6 d)和實驗第45天(ECT治療后6 d),水迷宮測試結(jié)束后即刻，從各組隨機選取5只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉，迅速斷頭并置于冰面上，分離大腦左右半球皮質(zhì)，剝離器暴露并取出海馬組織，置于-80 ℃冰箱保存。采用Western blot法測定海馬AMPK及p-AMPK的表達。在海馬組織中加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF(碧云天生物試劑研究所)進行冰上裂解2 h,超聲裂解、低溫離心取上清液,95 ℃變性5 min,-20 ℃冰箱凍存。檢測p-AMPK指標的組織裂解時，另需加入磷酸酶抑制劑(碧云天生物技術(shù)研究所)。采用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜(Millipore公司，美國)，加小鼠抗大鼠GAPDH內(nèi)參抗體(稀釋度1∶500)、AMPK一抗(稀釋度1∶500)、p-AMPK一抗(稀釋度1∶300)(Thermo公司，美國)置于搖床上室溫孵育2 h,磷酸鹽緩沖溶液(PBST)充分漂洗后加入辣根過氧化酶標記的二抗(稀釋度1∶6 000,北京中杉金橋科技公司)，搖床室溫孵育1 h,膜與化學發(fā)光底物孵育后顯影照相。采用Quantity one圖像分析軟件(Bio-Rad公司，美國)檢測AMPK和p-AMPK的灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達水平。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，服從正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間及組內(nèi)比較采用單因素方差分析(One-ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組定位航行實驗結(jié)果比較

與Ⅰ組比較,Ⅱ～Ⅴ組第32天時以及Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅴ組第44天時逃避潛伏期和游泳路徑明顯延長;與第5天時比較,Ⅱ～Ⅴ組第32天時以及Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅴ組第44天時逃避潛伏期和游泳路徑明顯延長;與Ⅲ組比較，Ⅳ組第44天時逃避潛伏期和游泳路徑明顯縮短，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1、2。

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較 s

Ⅰ組:正常對照組;Ⅱ組:模型組;Ⅲ組:電休克組;
Ⅳ組:電針+電休克組;Ⅴ組:Sham+電休克組。
與Ⅰ組比較,*P<0.05;與實驗第5天比較,#P<0.05;
與Ⅲ組比較,△P<0.05。

表2 各組大鼠游泳路徑比較 cm

Ⅰ組:正常對照組;Ⅱ組:模型組;Ⅲ組:電休克組;
Ⅳ組:電針+電休克組;Ⅴ組:Sham+電休克組。
與Ⅰ組比較,*P<0.05;與實驗第5天比較,#P<0.05;
與Ⅲ組比較,△P<0.05。

2.2 各組空間探索實驗結(jié)果比較

與Ⅰ組比較,Ⅱ～Ⅴ組第32天時及Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅴ組第44天時穿越平臺次數(shù)明顯減少;與第5天時比較,Ⅱ～Ⅴ組第32天時及Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅴ組第44天時穿越平臺次數(shù)明顯減少;與Ⅲ組比較,Ⅳ組第44天時穿越平臺次數(shù)明顯增多，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠穿越平臺次數(shù)比較 次

Ⅰ組:正常對照組;Ⅱ組:模型組;Ⅲ組:電休克組;
Ⅳ組:電針+電休克組;Ⅴ組:Sham+電休克組。
與Ⅰ組比較,*P<0.05;與實驗第5天比較,#P<0.05;
與Ⅲ組比較,△P<0.05。

2.3 各組海馬AMPK和p-AMPK表達比較

與Ⅰ組比較,Ⅱ～Ⅴ組第32天時及Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅴ組第44天時AMPK、p-AMPK表達水平明顯下調(diào);與第5天時比較,Ⅱ～Ⅴ組第32天時及Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅴ組第44天時AMPK、p-AMPK表達明顯下調(diào);與Ⅲ組比較,Ⅳ組第44天時AMPK、p-AMPK表達明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表4。

表4 各組大鼠海馬AMPK、p-AMPK表達水平比較

Ⅰ組:正常對照組;Ⅱ組:模型組;Ⅲ組:電休克組;Ⅳ組:電針+電休克組;Ⅴ組:Sham+電休克組。
AMPK:腺苷酸活化蛋白激酶;p-AMPK:磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶。
與Ⅰ組比較,*P<0.05;與實驗第5天比較,#P<0.05;與Ⅲ組比較,△P<0.05。

3 討 論

近年來，全球抑郁癥患者的人數(shù)正在持續(xù)增長，即將成為威脅人類生命健康的第二大疾病[11]。重度抑郁癥患者甚至有自殺傾向，給家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔。因此，抑郁癥的防治及其機制研究已經(jīng)成為醫(yī)學領(lǐng)域高度關(guān)注的熱點問題。

在抑郁癥的動物實驗中，有多種造模方法，包括使用藥物(利血平)、急性應(yīng)激、強迫游泳等。但是，大多存在模型特征性不穩(wěn)定、造模成功率低等弊端。慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(CUMS)可較好地模擬臨床中抑郁癥的發(fā)病過程，誘導(dǎo)類似的神經(jīng)生物學改變[12],具有模型穩(wěn)定、實施方便等特點，已逐步成為抑郁癥造模的經(jīng)典方法。本實驗中，作者采用CUMS刺激21 d后，各組大鼠均出現(xiàn)明顯的抑郁樣癥狀，證明造模成功。

電休克治療技術(shù)最早由意大利神經(jīng)精神病學家Ugo cerletti和Lucino Bini在1938年發(fā)明創(chuàng)造。與傳統(tǒng)的抗抑郁藥物相比，電休克可以更有效、更迅速地發(fā)揮其作用，而且通常只經(jīng)過幾次治療就能獲得明顯的臨床改善[13]。但是，治療后可導(dǎo)致嚴重的認知功能受損，其具體機制不明。Fraser等[14]推測可能與電刺激導(dǎo)致物理損傷以及麻醉藥物導(dǎo)致的腦細胞缺氧、代謝及遞質(zhì)紊亂有關(guān)。

百會穴為督脈經(jīng)穴，位于巔頂部，其深處為腦之所在，具有振奮諸陽、激發(fā)經(jīng)氣、醒腦開竅、益氣調(diào)神的功效，為治腦病要穴;印堂穴屬經(jīng)外奇穴，位于前額，兩眉頭的中間，具有通竅蘇厥、寧心安神、鎮(zhèn)驚止眩之效，其為臨床調(diào)神的主穴，能調(diào)節(jié)髓海機能，益智醒腦，發(fā)揮抗癡呆的效用[15]。針灸作為中國的傳統(tǒng)醫(yī)學方法，具有無毒、無副作用等特點，在腦功能保護方面更具獨特的效果。李斐斐等[16]研究發(fā)現(xiàn)，電針百會、大椎等穴位可提高小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸蛋白的表達，改善突觸的超微結(jié)構(gòu)，從而有效改善小鼠的學習記憶能力。

AMPK是一種蛋白激酶，由1個催化亞基(α亞基)和2個調(diào)節(jié)亞基(β亞基、γ亞基)組成的異三聚體[17]。最初從肝臟中分離出來，但3種亞基均可在人體和哺乳動物的多種組織中表達，包括肺、腎、心臟、骨骼肌和大腦[18]。AMPK在大多數(shù)哺乳動物組織和細胞類型中都有表達，包括在大腦神經(jīng)元中，它被認為在控制能量平衡方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[19]。AMPK可通過調(diào)節(jié)下游多種信號通路激活導(dǎo)致的認知功能障礙，具有重要的腦保護效應(yīng)[20]。

在本實驗中，電休克治療后各組大鼠的抑郁癥狀均得到了明顯的改善，說明電休克在緩解抑郁癥狀方面具有顯著效果。但是，治療后各組大鼠的學習記憶能力明顯下降，說明電休克在治療抑郁癥的同時可導(dǎo)致腦功能受損。電針預(yù)處理后，大鼠的逃避潛伏期和游泳路徑明顯短于電休克組，穿越平臺次數(shù)明顯增加，且海馬AMPK和p-AMPK的表達明顯上調(diào)，說明電針刺百會穴、印堂穴可以改善大鼠的學習記憶功能，可能與AMPK信號通路上調(diào)有關(guān)。在電休克治療中，進行電針預(yù)處理具有重要的腦功能保護效應(yīng)。

綜上所述，電針預(yù)處理不但可以提高電休克治療的效果，還可以減輕術(shù)后學習記憶能力的損害，其機制可能與上調(diào)AMPK信號通路有關(guān)。