Lnk基因敲除對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的影響

張艷青,華 婧,郭俊榮,朱明明,錢佳麗,徐月節(jié),許葉旻,鄧 彬

(1.揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理生理教研室,江蘇 揚州,225009;2.揚州大學(xué)附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科,江蘇 揚州,225012)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種炎癥性腸病，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。研究[1]認(rèn)為感染、免疫、遺傳因素是該病的可能發(fā)生機(jī)制，目前尚無有效治療方法。人類Lnk基因位于12q24,它編碼575個氨基酸，其翻譯的產(chǎn)物L(fēng)nk蛋白(SH2B adaptor protein3,SH2B3),屬于接頭蛋白SH2B家族的一員。Lnk蛋白結(jié)構(gòu)主要包括富含脯氨酸的氨基酸區(qū)域、PH結(jié)構(gòu)域、SH2結(jié)構(gòu)域和C-末端保守的酪氨酸殘基。Lnk蛋白主要表達(dá)于造血細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。Lnk在淋巴細(xì)胞和血細(xì)胞生成過程中主要起負(fù)調(diào)節(jié)作用。在Lnk敲除小鼠中，B細(xì)胞和造血干細(xì)胞的產(chǎn)生顯著增加[2]。最近有研究[3]表明,Lnk可調(diào)控炎癥相關(guān)的免疫細(xì)胞增殖及活性，在維持腸道穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用，但Lnk在UC中的作用尚不清楚。為了了解Lnk蛋白與UC的關(guān)系，本研究選用Lnk敲除小鼠，采用葡聚糖硫酸鈉(DSS)制作小鼠UC模型，觀察Lnk蛋白對UC的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

健康C57BL/6小鼠12只，購于揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心,Lnk敲除鼠12只，為江蘇省非編碼RNA基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化重點實驗室所有。所有實驗小鼠鼠齡6～7 周，體質(zhì)量18～22 g。DSS購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模:12只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為2組，每組6只。野生型組(WT)為正常對照組，每日進(jìn)飲用水及飼料，不做處理，共7 d;WT+DSS組為野生型小鼠結(jié)腸炎組，每日自由飲用2.5% DSS溶液，共 7 d。Lnk敲除鼠隨機(jī)分為2組，每組6只。Lnk敲除鼠組(KO)為Lnk敲除小鼠，每日進(jìn)飲用水及飼料，不做處理，共7 d;KO+DSS組為Lnk敲除小鼠結(jié)腸炎組，飲用2.5% DSS溶液，共7 d。實驗過程中每天對各組小鼠進(jìn)行稱重、記錄，觀察小鼠排出糞便情況。7 d后取外周血，處死全部小鼠，留取結(jié)腸組織做組織切片。

1.2.2 結(jié)腸炎癥的評價:為了評估結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度，每天檢測體質(zhì)量變化率和小鼠糞便性狀。體質(zhì)量變化率=(每天體質(zhì)量-實驗第1天體質(zhì)量)/實驗第1天體質(zhì)量×100%。正常小鼠糞便為干而小粒狀，半稀便為糊狀但不粘肛門，稀便為液狀而且粘肛門。觀察糞便顏色，是否有黑便及血便。小鼠腸組織切片觀察結(jié)果評價參照組織損傷評分標(biāo)準(zhǔn)[4],包括表面上皮細(xì)胞缺失、隱窩腺體損壞、黏膜炎癥細(xì)胞浸潤，分為0～4分，其中0分表示組織學(xué)特征為無改變;1分表示局部較輕;2分表示局部中等程度;3分表示廣泛中等程度;4分表示廣泛且嚴(yán)重。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Graph Pad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用q檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠一般狀況

WT組與KO組小鼠反應(yīng)靈敏，飲食、活動正常，毛發(fā)有光澤，無便血。WT+DSS組小鼠在飲用2.5% DSS溶液后第5～6天出現(xiàn)懶動、稀便、糞便發(fā)黑及便血，進(jìn)食和飲水量減少。KO+DSS組小鼠于第4～5天出現(xiàn)上述癥狀，且癥狀加重。

2.2 小鼠體質(zhì)量變化率

WT組與KO組體質(zhì)量略有增加,WT+DSS組與KO+DSS組體質(zhì)量均顯著降低(P<0.05),其中KO+DSS組體質(zhì)量變化率顯著大于WT+DSS組(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化率

2.3 小鼠腸長度比較

WT組與KO組小鼠腸外形正常，腸長度分別為(9.70±0.16)cm與(9.13±0.98)cm,2組比較無顯著差異(P>0.05)。WT+DSS組與KO+DSS組小鼠腸均有糜爛出血、淤血，長度分別為(6.77±0.17)、(5.10±0.25)cm,與WT組、KO組比較均顯著縮短(P<0.05),其中KO+DSS組較WT+DSS組顯著縮短(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組小鼠腸的長度

2.4 腸組織切片觀察

WT組與KO組腸組織切片顯示腸組織黏膜完整，腺體結(jié)構(gòu)清楚;WT+DSS組呈多病灶淺潰瘍，炎性細(xì)胞浸潤黏膜及黏膜下層;KO+DSS組呈多病灶淺潰瘍，明顯炎細(xì)胞浸潤，累及肌層。各組腸組織蘇木精-伊紅染色法(HE)鏡下表現(xiàn)見圖3。

圖3 各組腸組織HE染色鏡下表現(xiàn)

2.5 小鼠外周血中調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Breg)的細(xì)胞頻率檢測

取WT小鼠和KO小鼠的外周血，采用CD19與黏蛋白域基因-1(TIM-1)以及CD19與CD1d陽性標(biāo)記檢測Breg細(xì)胞頻率，發(fā)現(xiàn)KO小鼠外周血中Breg細(xì)胞頻率顯著低于WT組(P<0.05)。見圖4。

3 討 論

UC是一種原因不明的慢性非特異性炎性疾病，臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便等,UC病變通常累及直腸和乙狀結(jié)腸，侵及黏膜及黏膜下層，呈連續(xù)彌漫性分布，病情輕重不一，遷延不愈，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。UC的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，多數(shù)研究[5]認(rèn)為與免疫、遺傳、感染和精神等因素有關(guān)。以淋巴細(xì)胞為主的免疫細(xì)胞參與慢性非特異性炎癥，與UC密切相關(guān)，而Lnk蛋白在淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增和功能中起關(guān)鍵調(diào)控作用。在對乳糜瀉疾病的研究[6-7]中發(fā)現(xiàn),Lnk基因多態(tài)性可使細(xì)胞產(chǎn)生對細(xì)菌感染的強(qiáng)烈反應(yīng)，說明其對腸道具有抗細(xì)菌感染的保護(hù)性作用。因此,Lnk不僅可以作為UC的預(yù)測分子，也可以作為一個潛在的治療靶點。

圖4 野生型和Lnk敲除鼠外周血中Breg細(xì)胞頻率比較

Lnk可防止CD8+T細(xì)胞過度增殖，在Lnk敲除小鼠中,CD44hiIFN-γ+CD8+T細(xì)胞增多，小腸絨毛變短。CD8+T細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，提示Lnk在免疫細(xì)胞介導(dǎo)的腸道組織損傷中具有一定作用[3]。Lnk可以調(diào)節(jié)樹突細(xì)胞的產(chǎn)生和功能。Lnk敲除小鼠的脾和淋巴結(jié)中樹突狀細(xì)胞(DCs)數(shù)目增加，與野生型小鼠相比,Lnk敲除鼠的DCs促進(jìn)T細(xì)胞從幼稚的CD4+T細(xì)胞向產(chǎn)生γ干擾素(IFN-γ)的Th1細(xì)胞分化的能力明顯增強(qiáng)，產(chǎn)生IFN-γ的Th1細(xì)胞在細(xì)胞免疫中起重要作用，提示Lnk/SH2B3可以影響外周淋巴組織的細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)[8]。除了以上免疫相關(guān)細(xì)胞外,Lnk對B淋巴細(xì)胞的生成過程也具有調(diào)節(jié)作用[9]。Lnk敲除小鼠脾臟中前B細(xì)胞和不成熟B細(xì)胞明顯增多，說明Lnk可負(fù)調(diào)節(jié)B細(xì)胞的產(chǎn)生[10]。Lnk通過抑制IL-7/JAK/STAT信號通路抑制前B細(xì)胞增殖和白血病發(fā)展[11]。

本研究觀察Lnk敲除后對小鼠結(jié)腸炎的影響，結(jié)果顯示,Lnk敲除小鼠結(jié)腸炎的癥狀更加嚴(yán)重，同時還發(fā)現(xiàn)Lnk敲除小鼠外周血中Breg數(shù)量顯著少于野生型小鼠。Breg是起負(fù)調(diào)節(jié)作用的B細(xì)胞亞群，可以抑制免疫反應(yīng)，主要通過分泌白細(xì)胞介素-10(IL-10)行使其免疫負(fù)調(diào)控作用。研究[12]顯示Breg參與包括UC在內(nèi)的很多免疫紊亂性疾病的發(fā)生、發(fā)展。臨床研究顯示,UC患者外周血中的Breg細(xì)胞數(shù)量顯著減少,IL-10產(chǎn)生明顯減少。在T細(xì)胞受體α敲除小鼠自發(fā)性結(jié)腸炎模型中,B細(xì)胞可以通過產(chǎn)生CD1d上調(diào)Breg細(xì)胞產(chǎn)生IL-10的水平，保護(hù)結(jié)腸免于炎癥損傷[13]。也有研究[14]顯示脾臟B細(xì)胞暴露于腸道菌群時，可獲得免疫抑制功能，通過IL-10依賴的途徑抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的結(jié)腸炎。在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中，B細(xì)胞缺乏可使結(jié)腸炎加重，給予B細(xì)胞可減輕結(jié)腸炎癥狀，而且給予不產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞同樣使結(jié)腸炎癥狀減輕，說明B細(xì)胞抑制腸道炎癥反應(yīng)也可以通過非IL-10途徑實現(xiàn)[15]。

綜上所述,Lnk敲除小鼠表現(xiàn)為更加嚴(yán)重的結(jié)腸炎癥狀，提示Lnk對于結(jié)腸炎的發(fā)生具有抑制作用，其機(jī)制可能與Lnk對免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)Lnk敲除鼠外周血中Breg細(xì)胞顯著減少，而Lnk對于Breg細(xì)胞這一影響的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究探討。