薏苡仁油誘導(dǎo)胃癌細胞SGC-7901凋亡的實驗研究

孫國壯,曹有軍,毛海燕,羅 恒,何子渡,孔桂美

(1.揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院,江蘇 揚州,225000;2.江蘇省盱眙縣人民醫(yī)院 檢驗科,江蘇 淮安,211700;3.江蘇省南京明基醫(yī)院 化療科,江蘇 南京,210000)

中國是胃癌高發(fā)國家，胃癌發(fā)病率在全球居于第4位，病死率排名第3位[1-2],而胃癌的發(fā)病率與病死率在中國惡性腫瘤排名中均居第2位[3]。國內(nèi)外對胃癌的治療一般采用手術(shù)及放化療方式，但手術(shù)主要針對早期胃癌患者，而放化療藥物導(dǎo)致的不良反應(yīng)與耐藥，會損害機體的免疫機能，降低患者的生活質(zhì)量與生存率[4-5]。目前針對胃癌的放化療藥物相對較少，針對胃癌晚期的藥物也只有5-氟尿嘧啶、順鉑等。

在研究胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中，中醫(yī)藥理論[6]認為是患者機體陰陽失衡，經(jīng)絡(luò)失常及多種復(fù)雜的發(fā)病機制導(dǎo)致胃癌的產(chǎn)生與發(fā)展。與西藥相比，中藥在治療腫瘤相關(guān)疾病的過程中具有獨特的作用，可以作為放化療藥物的輔助藥，改善患者的生存率與預(yù)后[7-9]。研究[6]表明，中醫(yī)藥主要是通過中藥活血化瘀、疏肝和胃等方面作用，調(diào)節(jié)機體的免疫反應(yīng)，但具體機制仍不明確。薏苡仁油是薏苡仁的活性成分，主要成分為薏苡仁酯，具有調(diào)節(jié)機體免疫、抗腫瘤等多方面功效[10-11]。研究[12]表明，薏苡仁油可以抑制胰腺癌細胞的生長并誘導(dǎo)其凋亡。另有研究[13]發(fā)現(xiàn)，去甲斑蝥素與薏苡仁油合用可以協(xié)同誘導(dǎo)細胞凋亡，并通過下調(diào)調(diào)節(jié)性T細胞來抑制肝癌細胞的生長。

蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5(PRMT5)在多種腫瘤中高表達，有研究[14-15]證實PRMT5的敲低可以延緩肺癌細胞系A(chǔ)549和H1299細胞的生長。PI3K-AKT信號通路與細胞的增殖與凋亡密切相關(guān)，有研究[16-18]顯示，多種腫瘤中相關(guān)腫瘤標志物的高表達與PI3K/AKT信號通路密切相關(guān)。研究[15]表明,PRMT5能夠激活PI3K/AKT信號傳導(dǎo)和G1細胞周期蛋白，從而調(diào)節(jié)細胞生長，在使用PI3K抑制劑LY294002抑制PI3K活性后，發(fā)現(xiàn)PRMT5的表達也被降低，腫瘤細胞的生長被抑制，表明PI3K在調(diào)節(jié)PRMT5所依賴的細胞生長中起著重要作用。

本課題組前期研究[19]發(fā)現(xiàn)PRMT5在胃癌組織中高表達，與胃癌的發(fā)生與發(fā)展有一定關(guān)系，但對具體機制尚未深入研究。關(guān)于薏苡仁油通過PRMT5與PI3K/AKT信號通路抑制胃癌細胞生長，國內(nèi)外文獻中尚未見相關(guān)報道。本實驗擬通過薏苡仁油注射液抑制胃癌細胞的增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡，并探討其具體作用機制，旨在為薏苡仁油在臨床作為潛在的胃癌治療藥物輔助應(yīng)用于聯(lián)合放化療提供新的策略，也為其進一步臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)與理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細胞株SGC-7901(中國科學(xué)院上海細胞庫),RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液(Gibco公司)、胎牛血清(美國Gimni公司)、MTT和胰蛋白酶(Sigma公司)，結(jié)晶紫、凋亡試劑盒、ECL試劑盒(碧云天生物有限公司)，Transwell小室、Matrigel(美國BD公司)、PRMT5、β-actin(CST公司)、薏苡仁油注射液(康萊特藥業(yè)有限公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

SGC-7901用1 640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)(10%的胎牛血清,1%青霉素鏈霉素)，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長到85%左右時進行常規(guī)的傳代與換液，選取處于對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 MTT法檢測細胞的增殖

取對數(shù)生長期的胃癌SGC-7901細胞,0.25%的胰酶消化，每孔5×103個細胞接種96孔細胞培養(yǎng)板,24 h后，加入不同濃度的薏苡仁油注射液(濃度分別為1、2、4、5、6、8 mg/mL),設(shè)磷酸緩沖鹽溶液(PBS)為空白對照組，每組5個復(fù)孔,24 h后，每孔加入20 μL的MTT(5 mg/mL)溶液，置37 ℃培養(yǎng)箱4 h,棄掉96孔板中的液體，每孔加入150 μL的二甲基亞砜(DMSO),搖床振蕩10 min后，酶標儀(波長490 nm)測定每孔的吸光度(A)值。細胞的抑制率(%)=(1-加藥組A值/對照組A值)×100%。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡

胃癌SGC-7901細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，根據(jù)MTT的結(jié)果，選取薏苡仁油注射液(2、4、8 mg/mL)分別加入6孔板中，對照組加入不含藥物的1 640完全培養(yǎng)液，每組3個復(fù)孔。24 h后，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化細胞離心，細胞計數(shù)1×106個/mL,用100 μL結(jié)合緩沖液(Binding Buffer)重懸細胞加入流式管中，加入5 μL磷脂結(jié)合蛋白V(Annexin V)和10 μL碘化丙啶(PI),混勻后室溫避光孵育15 min,在管中加入400 μL PBS,流式細胞儀檢測分析數(shù)據(jù)。

1.5 劃痕實驗檢測細胞的遷移

將對數(shù)生長期的SGC-7901細胞接種于6孔板中，接種密度為5×105個/mL,培養(yǎng)24 h后，用10 μL無菌槍頭在6孔板上劃3條橫線,PBS清洗劃下的細胞3次，分別加入薏苡仁油注射液(2、4、8 mg/mL)于6孔板中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下拍照，測量細胞劃痕的相對距離。實驗重復(fù)3次。

1.6 Transwell小室檢測細胞的侵襲

用預(yù)冷的無血清的培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠，預(yù)冷的槍頭吸取40 μL的Matrigel膠均勻鋪入小室的上室內(nèi),37 ℃培養(yǎng)箱孵育5 h,待Matrigel膠凝固后，取200 μL(1×105個/mL)對數(shù)生長期的SGC-7901細胞加入上室，再用不同濃度薏苡仁油注射液進行處理，下室加入含有10%血清的1 640培養(yǎng)基500 μL。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取出小室用棉簽將上室基質(zhì)膠和沒有侵襲的細胞擦拭干凈,0.1%結(jié)晶紫染色下室20 min。倒置顯微鏡(100倍)觀察遷移細胞，隨機選取5個視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)。

1.7 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達

取不同濃度薏苡仁油處理24 h后的SGC-7901,胰酶消化收集細胞，細胞總蛋白提取試劑盒提取細胞中的總蛋白,BCA法測定總蛋白含量，繪制標準曲線，計算上樣量。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉(zhuǎn)膜，洗滌緩沖液(TBST)搖床洗脫3次，每次5 min,5%脫脂奶粉封閉1 h,一抗4 ℃孵育過夜,TBST搖床洗脫3次，每次5 min,二抗孵育2 h,TBST搖床再洗脫3次，每次5 min,使用增強發(fā)光ECL試劑盒進行發(fā)光，凝膠圖像分析系統(tǒng)采集目的蛋白條帶圖像進行分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 薏苡仁油能抑制胃癌SGC-7901細胞的增殖

MTT實驗顯示結(jié)果見圖1,不同濃度的薏苡仁油均可抑制胃癌SGC-7901細胞的增殖，其中2、4 mg/mL的薏苡仁油對SGC-7901細胞抑制率分別為(30.02±1.56)%和(23.15±0.89)%,其中2 mg/mL組與空白對照組相比差異極顯著(P<0.01),4 mg/mL組與空白對照組比較差異顯著(P<0.05)。

與0 mg/mL相比, *P<0.05, **P<0.01圖1 薏苡仁油抑制胃癌SGC-7901細胞的增殖

2.2 薏苡仁油能誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細胞凋亡

根據(jù)2.1的實驗結(jié)果，選取2、4、8 mg/mL的薏苡仁油注射液處理胃癌SGC-7901細胞24 h,流式細胞儀檢測凋亡情況。結(jié)果顯示,2、4、8 mg/mL的薏苡仁油都能夠誘導(dǎo)SGC-7901細胞凋亡，與空白對照組凋亡率為(2.00±1.22)%相比,2、4 mg/mL組凋亡率較高,2、4、8 mg/mL組的凋亡率分別為(16.25±2.54)、(12.60±1.12)、(7.88±1.67)%,其中2 mg/mL組和4 mg/mL組與對照組凋亡率相比差異極顯著(P<0.01),8 mg/mL組與空白對照組凋亡率對比差異顯著(P<0.05)。見圖2。

與0 mg/mL相比, *P<0.05, **P<0.01圖2 薏苡仁油誘導(dǎo)SGC-7901細胞的凋亡

2.3 薏苡仁油能抑制胃癌SGC-7901細胞遷移

2、4、8 mg/mL的薏苡仁油注射液處理胃癌SGC-7901細胞24 h后，細胞的遷移均能抑制，空白對照組中間間距為(435.00±2.39)μm,2、4、8 mg/mL的間距分別為(643.00±1.16)、(539.00±0.58)、(464.00±2.11)μm。其中2 mg/mL組和4 mg/mL組與空白對照組相比差異極顯著(P<0.01)。見圖3。

A:0 mg/mL;B:2 mg/mL;C:4 mg/mL;D:8 mg/mL。與0 mg/mL相比,*P<0.05,**P<0.01。

圖3 薏苡仁油抑制SGC-7901細胞的遷移(100倍)

2.4 薏苡仁油抑制胃癌SGC-7901細胞侵襲

選取2、4、8 mg/mL的薏苡仁油注射液處理胃癌SGC-7901細胞24 h,Transwell小室結(jié)果表明，結(jié)晶紫染色后顯微鏡下觀察，與對照組細胞侵襲數(shù)(268.00±2.05)個相比,2、4、8 mg/mL的薏苡仁油注射液處理過的SGC-7901細胞均能不同程度抑制細胞的侵襲，遷移數(shù)分別為(134.00±2.86)、(167.00±0.99)和(203.00±2.97)個。2 mg/mL組和4 mg/mL組與空白對照組細胞侵襲數(shù)相比差異極顯著(P<0.01),8 mg/mL組與空白對照組細胞侵襲數(shù)對比有顯著差異(P<0.05)。見圖4。

2.5 薏苡仁油下調(diào)胃癌SGC-7901細胞PRMT5的表達

Western blot結(jié)果表明，隨著薏苡仁油濃度的升高,PRMT5、PI3K和AKT蛋白的表達顯著降低,2、4、8 mg/mL組與空白對照組相比差異極顯著(P<0.001)。見圖5。

3 討 論

胃癌的發(fā)病率一直占據(jù)全球腫瘤發(fā)病率的前列，放化療藥物雖然可以提高患者的存活率，但其在治療過程中對機體產(chǎn)生的不良反應(yīng)讓患者難以耐受，故而在治療周期中有很多患者中途放棄治療。面對胃癌治療的現(xiàn)狀，臨床治療中迫切需要新型藥物的出現(xiàn)，該藥物既要降低放化療藥物對機體產(chǎn)生的不良反應(yīng)，又要提高對胃癌治療的療效，改善患者的生活質(zhì)量。有研究[9]表明，部分中藥在治療惡性腫瘤的過程中發(fā)揮著重要作用，是西藥不能比擬的。薏苡仁油注射液作為臨床配合放化療藥的輔助用藥，對于原發(fā)性非小細胞肺癌和肝癌的治療效果較為顯著[10]。本研究結(jié)果表明，薏苡仁油注射液可以抑制胃癌SGC-7901細胞的增殖，而有研究[20]發(fā)現(xiàn)，薏苡仁油注射液聯(lián)合化療藥物治療胃癌患者，可明顯改善患者的生活質(zhì)量，但對相關(guān)具體機制并沒有深入研究。

A:0 mg/mL;B:2 mg/mL;C:4 mg/mL;D:8 mg/mL。與0 mg/mL相比,*P<0.05,**P<0.01。

圖4 薏苡仁油抑制SGC-7901細胞的侵襲(100倍)

A:0 mg/mL;B:2 mg/mL;C:4 mg/mL;D:8 mg/mL。與0 mg/mL相比,***P<0.001。

圖5 薏苡仁油對SGC-7901細胞PRMT5蛋白表達的影響

蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶參與多個細胞生物學(xué)過程，包括腫瘤的形成、細胞增殖分化與凋亡，而PRMT5作為Ⅱ型蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，在多種腫瘤中高表達。本課題組在前期研究的基礎(chǔ)上，確認了PRMT5在胃癌中的高表達。關(guān)于PTMT5與PI3K/AKT在胃癌中如何調(diào)節(jié)細胞的進展，并沒有相關(guān)文獻報道，本研究首次從薏苡仁油與PTMT5、PI3K/AKT信號通路著手，研究其與胃癌發(fā)生發(fā)展機制的關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)薏苡仁油可以顯著抑制胃癌SGC-7901細胞的增殖，可能的作用機制與誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)，并且探討抑制SGC-7901細胞增殖的最佳藥物濃度，在選擇適宜藥物濃度條件下，驗證了凋亡、遷移、侵襲，并進一步確定了薏苡仁油誘導(dǎo)SGC-7901細胞凋亡的藥物濃度,2、4 mg/mL濃度可以顯著抑制SGC-7901細胞的增殖、遷移與侵襲，并誘導(dǎo)胃癌細胞的凋亡。

本實驗通過Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在用不同濃度的薏苡仁油處理胃癌SGC-7901細胞后,PRMT5、PI3K和AKT蛋白的表達水平在薏苡仁油濃度為2、4 mg/mL時，蛋白的表達顯著降低，而8 mg/mL組蛋白的表達水平升高及8 mg/mL組細胞凋亡率顯著低于2、4 mg/mL藥物組，可能的原因是薏苡仁油是從中藥薏苡仁中提取的活性物質(zhì)，具有雙向調(diào)節(jié)的作用，劑量不同發(fā)揮的作用功效也不同。中藥本身作用比較復(fù)雜，許多中藥使用不同劑量，針對不同機體，也具有雙向調(diào)節(jié)的作用?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中首次明確記載部分中藥具有雙向調(diào)節(jié)作用，《傷寒論》和《金匱要略》中也體現(xiàn)了部分藥物具有雙向調(diào)節(jié)功能，而藥理論中也常有“劑量-效果”作用相反的現(xiàn)象。如《中藥學(xué)》中，麥芽小劑量可以催乳，大劑量回乳；柴胡小劑量可以抑制大鼠排尿，大劑量可以促進排尿[21-23]。因此，隨著薏苡仁油注射液用藥劑量的不同，針對不同腫瘤細胞，可以出現(xiàn)相反的治療結(jié)果，對細胞惡性表型作用效果也不同。

此前研究[15]報道PRMT5與PI3K/AKT信號通路直接相關(guān)，肺癌中PI3K的失活可以抑制PRMT5依賴的細胞增殖。本次實驗選取細胞系為胃癌SGC-7901細胞，實驗結(jié)果初步說明薏苡仁油可以通過降低PRMT5蛋白的表達誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細胞凋亡，其凋亡機制之一可能是通過PRMT5-PI3K/AKT信號通路。

綜上所述，薏苡仁油可以有效抑制胃癌細胞的侵襲與遷移，其機制可能是通過PRMT5-PI3K/AKT信號通路誘導(dǎo)其凋亡。本研究的不足之處為缺乏臨床病理胃癌及癌旁標本與動物實驗?zāi)Ｐ偷尿炞C，下一步研究方向?qū)RMT5進行siRNA敲低與過表達，進一步驗證之前所得的結(jié)果，并通過動物造模，明確薏苡仁油與PRMT5在胃癌發(fā)生、發(fā)展中確切的機制，為未來的臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持與理論基礎(chǔ)，具體的作用機制有待進一步研究。