復(fù)合果蔬發(fā)酵汁對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的作用研究

尹 曼 董 哲 王 憬 張海欣 劉 艷 谷瑞增 魏 穎*

（1 中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 北京100015 2 北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心 北京100015）

果蔬發(fā)酵汁是風(fēng)靡于我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)及日本的植物功能食品，又可稱為水果酵素，指以一種或多種新鮮果蔬、菌菇、中草藥等為原料，經(jīng)多種或單一菌株發(fā)酵而成的果蔬汁類飲料。果蔬發(fā)酵汁大多采用乳酸菌發(fā)酵，利用乳酸菌代謝產(chǎn)生與酸味呈正相關(guān)的γ-氨基丁酸和可口酸味的琥珀酸等小分子有機(jī)酸，產(chǎn)生醛類、醇類和羧酸類等芳香成分，增加果蔬汁的口感風(fēng)味；同時(shí)發(fā)酵可引起植物細(xì)胞的降解，引起不同抗氧化物質(zhì)的釋放與合成，增加果蔬汁的抗氧化力[1-2]；一些乳酸菌株還具有高產(chǎn)γ-氨基丁酸[3]和胞外多糖[4]的能力，在改善口感的同時(shí)對(duì)人體產(chǎn)生益生功效。

果蔬發(fā)酵汁中的功能性物質(zhì)主要包括多糖類、多酚類和黃酮類，多糖是以免疫調(diào)節(jié)聲稱最多的功能性物質(zhì)，可通過(guò)刺激巨噬細(xì)胞、T/B 淋巴細(xì)胞、NK 細(xì)胞的活化與增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和抗體的分泌等直接作用增強(qiáng)免疫力，亦可通過(guò)提高體內(nèi)與免疫相關(guān)金屬離子如鈣離子、 銅離子等來(lái)增強(qiáng)機(jī)體免疫力[5]；多酚類和黃酮類具有重要的抗氧化作用，作為還原介質(zhì)（自由基終止劑）、金屬螯合劑、單線態(tài)氧猝滅劑或H+受體來(lái)清除體內(nèi)過(guò)多的自由基[2]，有研究表明體內(nèi)免疫細(xì)胞在抵抗病原體入侵的同時(shí)本身就會(huì)產(chǎn)生較多的活性氧，處于慢性氧化應(yīng)激的狀態(tài)[6]。保護(hù)免疫細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷會(huì)對(duì)增強(qiáng)機(jī)體免疫具有重要作用。本試驗(yàn)研究的復(fù)合果蔬發(fā)酵汁以蘋果、香蕉、梨、葡糖、哈密瓜、西瓜、黑木耳、銀耳、胡蘿卜、白蘿卜、西葫蘆、火龍果、枸杞、香菇、西紅柿、黃瓜和山藥為原料，以乳酸菌發(fā)酵為主，配合酵母菌發(fā)酵的果蔬發(fā)酵飲品。主要考察復(fù)合果蔬發(fā)酵果蔬汁對(duì)小鼠脾淋巴的促增殖作用和抗氧化能力，同時(shí)對(duì)果蔬發(fā)酵汁的成分按照溶劑極性大小，用水、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯和氯仿進(jìn)行萃取，探討其中起免疫調(diào)節(jié)作用的主要組分，為果蔬發(fā)酵汁的開發(fā)奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

復(fù)合果蔬發(fā)酵汁，自制研發(fā)產(chǎn)品；小鼠（Balb/c，6～8 周齡），北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；刀豆蛋白A、脂多糖、MTT、DCFH-DA、AAPH，Sigma 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基，Hyclone 公司；胎牛血清（FBS），四季青公司；胰蛋白酶、紅細(xì)胞裂解液、緩沖液PBS、青霉素鏈霉素溶液（雙抗），碧云天生物技術(shù)研究所；蘆丁、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，中檢所；無(wú)水葡萄糖，北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司；DMSO，西隴化工股份有限公司；無(wú)水乙醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇，北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Spectra MR 多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Dynex 公司；ESCO AC2-6S1 生物安全柜，新加坡藝思高科技有限公司；HF90 二氧化碳培養(yǎng)箱，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；BD C6 流式細(xì)胞儀；KQ-250E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；IKA RV10 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)IKA；真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；3K15 冷凍離心機(jī)，Sigma。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 復(fù)合果蔬發(fā)酵汁分極萃取及成分分析

1.3.1.1 復(fù)合果蔬發(fā)酵汁的分極萃取 向果蔬發(fā)酵汁中加入10 倍體積90%的乙醇，室溫靜止過(guò)夜，于60 ℃下超聲萃取40 min，離心合并醇溶組分，此作為多酚和黃酮提取液；殘?jiān)苡? 倍發(fā)酵液體積的蒸餾水中，于60 ℃下超聲萃取50 min，過(guò)濾，收集水溶組分，此作多糖提取液；殘?jiān)谜麴s水洗滌下來(lái)，作為發(fā)酵汁殘?jiān)?。分別將醇溶組分和水溶組分進(jìn)行旋蒸濃縮，并與殘?jiān)M(jìn)行真空冷凍干燥，得各組分干物質(zhì)，并計(jì)算所占發(fā)酵汁總干物質(zhì)比重。

取醇溶組分凍干物溶于4 倍體積的蒸餾水中，加入3 倍體積的氯仿相，磁力攪拌30 min，分離氯仿相和水相；水相中加入3 倍體積的乙酸乙酯，磁力攪拌30 min，分離乙酸乙酯相和水相；水相中加入3 倍體積的正丁醇，磁力攪拌30 min，分離正丁醇相和水相；之后將氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和最后所得水相分別減壓回收溶劑，真空冷凍干燥，得各組分干物質(zhì)，并計(jì)算所占發(fā)酵汁總干物質(zhì)比重。

1.3.1.2 復(fù)合果蔬發(fā)酵汁的成分分析 依據(jù)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NYT 1676-2008 《食用菌中粗多糖含量的測(cè)定》 檢測(cè)復(fù)合果蔬發(fā)酵汁及其分極萃取產(chǎn)物中多糖含量。

依據(jù)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY-T 1600-2008《水果、蔬菜及其制品中單寧含量的測(cè)定 分光光度法》檢測(cè)復(fù)合果蔬發(fā)酵汁及其分極萃取產(chǎn)物中多酚含量。

依據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 19416-2003 《山楂汁及其飲料中果汁含量的測(cè)定》 檢測(cè)復(fù)合果蔬發(fā)酵汁及其分極萃取產(chǎn)物中黃酮含量。

1.3.2 復(fù)合果蔬發(fā)酵汁及其萃取物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的影響[7]

1.3.2.1 小鼠脾細(xì)胞懸液的制備 將小鼠（Balb/c）頸椎脫臼處死，無(wú)菌取脾臟，剪碎、研磨，制備脾淋巴細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106個(gè)細(xì)胞/mL，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率大于95%。

1.3.2.2 復(fù)合果蔬發(fā)酵汁及其萃取物對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 MTT 法檢測(cè)奶粉對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響。將調(diào)整好細(xì)胞濃度的脾細(xì)胞懸液100 μL/孔接入到96 孔板中，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組和試驗(yàn)組，試驗(yàn)組加入不同稀釋倍數(shù)的果蔬發(fā)酵汁，于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，離心棄上清液，每孔加入0.5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，加入DMSO 100 μL，振蕩使溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD490nm值，增殖率計(jì)算公式：

1.3.2.3 果蔬發(fā)酵汁及其萃取物對(duì)T/B 淋巴細(xì)胞增殖的影響 將調(diào)整好濃度的脾細(xì)胞懸液按100 μL/孔加入到96 孔板中，設(shè)置試驗(yàn)組、模型組和空白對(duì)照組，模型組分別加入終質(zhì)量濃度5 μg/mL的LPS 和終質(zhì)量濃度10 μg/mL ConA，試驗(yàn)組在加入LPS 和Con A 的同時(shí)加入復(fù)合果蔬發(fā)酵汁及各分極萃取物質(zhì)，每組做4 個(gè)復(fù)孔，將培養(yǎng)板置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。之后，離心棄上清液，每孔加入0.5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，加入DMSO 100 μL，振蕩使溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD490nm值，對(duì)T/B 淋巴細(xì)胞增殖作用結(jié)果用刺激指數(shù)（Stimulation index，SI）表示，計(jì)算如下：

1.3.2.4 復(fù)合果蔬發(fā)酵汁萃取物對(duì)脾淋巴細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 用AAPH 誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞建立細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各萃取物對(duì)脾淋巴細(xì)胞胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生量的影響。設(shè)置空白對(duì)照組、模型組和試驗(yàn)組，試驗(yàn)組分別加入不同濃度萃取物質(zhì)，除對(duì)照組外每孔再加入終濃度為800 μmol/L 的AAPH。胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生量以細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度（%）來(lái)表示，相對(duì)熒光強(qiáng)度（%）=試驗(yàn)組的熒光值/模型組的熒光值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，試驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（Mean±SD）表示。采用組間t 檢驗(yàn)，P<0.05 具有顯著性差異，P<0.01 具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合果蔬發(fā)酵汁及其萃取物質(zhì)成分分析

果蔬中含有低聚糖、多糖、功能性脂類、氨基酸和酚類等具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化、促進(jìn)腸道菌平衡等功效的功能性成分，果蔬發(fā)酵汁經(jīng)過(guò)接種前和灌裝階段的高溫滅菌處理后，其營(yíng)養(yǎng)功能性成分主要為多糖、 多酚和黃酮等具有一定熱穩(wěn)定性的物質(zhì)。本試驗(yàn)主要以多糖類、多酚類和黃酮類物質(zhì)為主線來(lái)分析果蔬汁中起功效的主要組分。其中復(fù)合果蔬發(fā)酵汁中含有總多糖含量為（1.81±0.021）mg/mL，總多酚為（1.45±0.15）mg/mL，總黃酮為（606.61±25.13）μg/mL。所提取出的各組分成分含量如表1中所述，水溶組分中除多糖類物質(zhì)外，還含有一定量的多酚類物質(zhì)，醇溶組分中以多酚類和黃酮類為主。

表1 復(fù)合果蔬發(fā)酵汁各萃取物成分含量Table 1 Extracts compositions analysis of compound fermented fruit and vegetable juice

2.2 果蔬發(fā)酵汁對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的影響

乳酸菌會(huì)代謝果蔬汁中的碳水化合物產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，經(jīng)發(fā)酵后果蔬汁中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和pH值均會(huì)發(fā)生變化 （果蔬汁發(fā)酵前pH 值為6.5，發(fā)酵后pH 值為3.9），復(fù)合果蔬汁在發(fā)酵前、發(fā)酵后pH 調(diào)整至6.5 及復(fù)合果蔬發(fā)酵汁對(duì)小鼠對(duì)T 淋巴細(xì)胞增殖的影響見圖1，對(duì)B 淋巴細(xì)胞增殖的影響見圖2。由圖1、圖2可知，相比于發(fā)酵前，復(fù)合果蔬發(fā)酵汁具有一定促進(jìn)T/B 淋巴細(xì)胞增殖的作用，說(shuō)明果蔬汁經(jīng)發(fā)酵后具有一定增強(qiáng)免疫的功效；相比于復(fù)合果蔬汁發(fā)酵后pH 調(diào)整至6.5，復(fù)合果蔬發(fā)酵汁對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞也具有較好的促增殖作用，說(shuō)明發(fā)酵后產(chǎn)生的有機(jī)酸對(duì)免疫調(diào)節(jié)具有增強(qiáng)作用。

關(guān)于果蔬發(fā)酵汁增強(qiáng)免疫力的研究已有報(bào)道，王智鼎等人[8]研究發(fā)現(xiàn)灌胃小鼠混合果蔬發(fā)酵飲品30 d，可促進(jìn)小鼠T/B 淋巴細(xì)胞增殖、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能；吳彬彬等[9]研究發(fā)現(xiàn)灌胃S180荷瘤小鼠植物果蔬發(fā)酵液可改善其免疫調(diào)節(jié)功能。關(guān)于有機(jī)酸免疫調(diào)節(jié)作用的研究報(bào)道，主要是將其添加到飼料中，促進(jìn)家禽的生長(zhǎng)性能[10-11]。同時(shí)，果蔬富含多酚類物質(zhì)，乳酸菌會(huì)降解植物細(xì)胞，分解大分子酚類物質(zhì)為小分子[12-13]，一些小分子酚酸如綠原酸[14]會(huì)對(duì)機(jī)體免疫具有促進(jìn)作用。

2.3 復(fù)合果蔬發(fā)酵汁萃取物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的影響

果蔬發(fā)酵汁各萃取物質(zhì)對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響見圖3。試驗(yàn)從果蔬發(fā)酵汁中萃取得到了水溶組分和醇溶組分，從醇溶組分中又按溶劑極性大小萃取得到氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，共6 個(gè)組分，分別選取各組分的4 個(gè)濃度研究其對(duì)脾淋巴細(xì)胞的作用程度。由圖4可知，所選各組分的4 個(gè)濃度均不會(huì)影響脾淋巴細(xì)胞的正常生長(zhǎng)代謝。具體通過(guò)各組分物質(zhì)對(duì)T/B 淋巴細(xì)胞的促增殖結(jié)果來(lái)判斷各組分的免疫促進(jìn)作用，得到最佳的功效組分。

圖1 果蔬發(fā)酵汁對(duì)ConA 誘導(dǎo)的小鼠T 淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of compound fermented fruit and vegetable juice on proliferation of T lymphocyte

圖2 果蔬發(fā)酵汁對(duì)LPS 誘導(dǎo)的B 淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of compound fermented fruit and vegetable juice on proliferation of B lymphocyte

圖3 果蔬發(fā)酵汁萃取物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of extracts of compound fermented fruit and vegetable juice on proliferation of murine splenocytes

圖4 水溶組分和醇溶組分對(duì)Con A 誘導(dǎo)的小鼠T 淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of water soluble and alcohol components of the juice on proliferation of T lymphocyte

水溶組分和醇溶組分對(duì)T/B 淋巴細(xì)胞增殖作用的影響見圖4、圖5。由圖4可知，醇溶組分相比來(lái)說(shuō)具有較好促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞增殖的作用；由圖5可知，醇溶組分和水溶組分對(duì)B 淋巴細(xì)胞的增殖均沒(méi)有顯著性的影響，但醇溶組分相比水溶組分來(lái)說(shuō)仍具有較好的作用。故本試驗(yàn)最終將從醇溶組分中篩選得到免疫調(diào)節(jié)最佳功效組分。

從醇溶組分中萃取得到的各相對(duì)T/B 淋巴細(xì)胞增殖的影響見圖6、圖7。由圖6可知，正丁醇相具有較好促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞增殖的作用，氯仿相、水相均在較高濃度下具有較好促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞增殖的功效，而乙酸乙酯相對(duì)T 淋巴細(xì)胞的促增殖作用表現(xiàn)不明顯；由圖7可知，正丁醇相和水相相對(duì)來(lái)說(shuō)對(duì)B 淋巴細(xì)胞的促增殖作用表現(xiàn)比較明顯，而乙酸乙酯相在200 μg/mL 下對(duì)B 淋巴細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用（P<0.05）。

圖8為醇溶組分各相對(duì)脾淋巴細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響，各組分均具有極顯著的抑制胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的作用（P<0.01），保護(hù)脾淋巴細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷。乙酸乙酯相中所含酚類和黃酮類最多，其活性氧清除能力亦較強(qiáng)。關(guān)于酚類物質(zhì)抗炎作用——抑制T/B 淋巴細(xì)胞增殖的文獻(xiàn)報(bào)道也比較多，本文主要是篩選促進(jìn)T/B 淋巴細(xì)胞增殖的組分，如前所述，機(jī)體免疫細(xì)胞本身就處于慢性氧化應(yīng)激的狀態(tài)，保護(hù)脾淋巴細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷對(duì)免疫細(xì)胞發(fā)揮其生理功效都具有重要的作用。

圖5 水溶組分和醇溶組分對(duì)LPS 誘導(dǎo)的小鼠B 淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effect of water soluble and alcohol components of the juice on proliferation of B lymphocyte

圖6 果蔬發(fā)酵汁醇溶各組分對(duì)ConA 誘導(dǎo)的小鼠T 淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.6 Effect of alcohol components of the juice on proliferation of T lymphocyte

圖7 果蔬發(fā)酵汁醇溶各組分對(duì)LPS 誘導(dǎo)的B 淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.7 Effect of alcohol components of the juice on proliferation of B lymphocyte

圖8 果蔬發(fā)酵汁醇溶各組分對(duì)脾淋巴細(xì)胞胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生量的影響Fig.8 Effect of the extracts of the juice on production of ROS in cells of murine splenocytes

植物多酚類物質(zhì)分子質(zhì)量在500～3 000 范圍內(nèi)，為極性有機(jī)化合物，可溶于水、乙醇、 乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。關(guān)于多酚的分離純化，通常采用有機(jī)溶劑分步萃取。植物多酚分子質(zhì)量不同，極性強(qiáng)弱也不同，在不同有機(jī)溶液中的溶解度也就有差異，有研究表明在一定分子質(zhì)量范圍內(nèi)，其分子質(zhì)量越大，含酚羥基越大，極性越大[15]。關(guān)于多酚類物質(zhì)定量分析方法主要包括紫外分光光度法和色譜法，色譜法可進(jìn)一步鑒別酚類物質(zhì)的種類及結(jié)構(gòu)[16]。植物黃酮類化合物亦屬于植物多酚，以C6-C3-C6 結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，包括黃酮、黃酮醇、黃烷酮（二氫黃酮）、異黃酮、查耳酮等，可溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有極溶劑，可用簡(jiǎn)單的顯色反應(yīng)對(duì)其種類進(jìn)行初步鑒定[17]。本試驗(yàn)從醇溶組分中萃取得到的4 個(gè)組分中還含有一定的糖類物質(zhì)，經(jīng)硅膠G 薄層層析鑒定主要為蔗糖、 多糖和少量的葡萄糖，且對(duì)醇溶組分進(jìn)行黃酮顯色反應(yīng)鑒定，其所含黃酮類物質(zhì)主要為黃酮和異黃酮。

3 結(jié)論

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)研制的果蔬發(fā)酵汁具有一定增強(qiáng)T/B 淋巴細(xì)胞增殖的能力。通過(guò)對(duì)果蔬發(fā)酵汁進(jìn)行萃取，得到水溶組分和醇溶組分，醇溶組分中按照溶劑極性大小又分離得到氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相。通過(guò)對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞作用的比較，得到最佳功效組分為正丁醇相，其所占果蔬發(fā)酵汁干物質(zhì)比例為11.33%。本試驗(yàn)果蔬發(fā)酵汁來(lái)源于17 種果蔬，造成發(fā)酵汁成分復(fù)雜，分析困難，試驗(yàn)通過(guò)對(duì)發(fā)酵汁進(jìn)行萃取，可以進(jìn)一步縮小分析范圍或者只是單純的純化酚類物質(zhì)，后期可通過(guò)多酚黃酮的顯色反應(yīng)結(jié)合原料中所含成分和高效液相色譜法進(jìn)一步去推測(cè)正丁醇相中所含物質(zhì)。通過(guò)最佳組分含量鑒定，可以進(jìn)一步研究其來(lái)源，篩選原料及工藝，得到具有更好功效的果蔬發(fā)酵產(chǎn)品。