液態(tài)乳中膽固醇、7-脫氫膽固醇及25-羥基膽固醇的同步測定方法

卓成飛 胡盛本 鄧澤元 劉 彪 葉文慧 李 靜*

（1 南昌大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室 南昌330047 2 伊利集團奶粉事業(yè)部技術(shù)研發(fā)部 呼和浩特010080）

膽固醇又稱膽甾醇，是一種環(huán)戊烷多氫菲的衍生物，是動物組織中類固醇激素，膽汁酸、維生素D 的前體。動物的內(nèi)臟、魚子、蛋黃、牛奶中膽固醇含量較高。通?？梢圆捎酶咝б合嗌V法[1-2]、氣相色譜法[3-5]、比色法[6-7]、超高效液相色譜法等方法測定[8-9]。膽固醇屬于不飽和的化合物，在紫外、熱、氧氣等作用下容易被氧化生成膽固醇氧化物（Cholesterol oxidation products，COPs），主要包括25-羥基膽固醇、7-脫氫膽固醇、20-羥基膽固醇、7-酮基膽固醇。大部分膽固醇氧化物具有很多負面作用，例如：COPs 可以增加血漿中內(nèi)皮細胞的Ca2＋滲透率，對細胞有一定的毒害作用[10]，致突變性和致癌性，且主要作用于早期階段[10-11]，導致固醇類化合物代謝紊亂[12]。然而，部分COPs 對身體也存在一定益處，例如：25-羥基膽固醇可以促進免疫細胞的活化，增加免疫介質(zhì)的產(chǎn)生[13]，也可以促進膜細胞體外鈣化[14-15]。7-脫氫膽固醇作為維生素D3 的前體，在日光或紫外線照射下可轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素D3，具有調(diào)節(jié)鈣、磷代謝的生物功能。

目前，國內(nèi)食品中膽固醇的測定主要采用國標GB/T 22220-2008 測定食品中膽固醇的含量，該法采用60%的KOH 溶液和無水乙醇對樣品中的膽固醇進行皂化[17]，石油醚和乙醚（體積比1∶1）提取皂化物。該方法中皂化所用有機試劑較多，提取時間長；其次，國標方法要求樣本量為0.25～10 g，其膽固醇含量約為0.5～5 mg，換算為液態(tài)乳的體積大約為3.8～38 mL，不利于原料較少，較為珍貴的樣品，例如母乳的測定；此外，對于含水量較高的液態(tài)乳，其膽固醇濃度較低，加入少量的皂化試劑即可完全皂化。可見，GB/T 22220-2008 中膽固醇皂化方法不適合含水量較高的液態(tài)乳和樣本量較少的母乳樣品中膽固醇的測定。作者擬基于GB/T2220-2008 方法，優(yōu)化皂化方法，得到適合液態(tài)乳的最優(yōu)皂化條件。

此外，前期試驗表明，采用GB/T 22220-2008中液相色譜條件分離膽固醇、25-羥基膽固醇和7-脫氫膽固醇，當流速為1.0 mL/min 時，膽固醇的峰分離效果不佳，而當流速改為0.8 mL/min 時，可達到最佳分離效果。該液相條件對于膽固醇的定量、定性測定比較穩(wěn)定，然而，對于同時測定樣品中膽固醇、25-羥基膽固醇和7-脫氫膽固醇的穩(wěn)定性不明確。

綜上所述，基于GB/T 22220-2008 方法，本試驗優(yōu)化液態(tài)乳中膽固醇的皂化條件，并驗證膽固醇、25-羥基膽固醇和7-脫氫膽固醇的液相色譜條件的回收率、穩(wěn)定性、精密度和準確度，為液態(tài)乳中膽固醇、25-羥基膽固醇和7-脫氫膽固醇的定性和定量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：市售伊利純牛奶，蒙牛優(yōu)鈣純牛奶，天天陽光純牛奶，成熟母乳、初乳（貯存于-80 ℃冰箱），伊利復原乳風味乳酸牛奶（原味），蒙牛風味酸牛奶（原味），天天陽光酸牛奶（原味），光明優(yōu)倍鮮牛奶，嬰兒配方奶粉（1 段：美芝寶；2 段：荷蘭牛欄；3 段：惠氏），伊利高蛋白脫脂高鈣奶粉，其中固態(tài)奶粉按包裝上的說明沖配成液態(tài)奶。

試劑：正己烷、無水乙醇、氫氧化鉀均為分析純，乙腈、甲醇為色譜級。膽固醇標品，美國Sigmaaldrich 公司；25-羥基膽固醇標品、7-脫氫膽固醇標品，加拿大TRC 公司。堿液：2 mol/L KOH 乙醇溶液 （稱取11.220 g KOH 用乙醇定容至100 mL）。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2204B 電子天平，上海精科天美科學儀器有限公司；TDL-5-A 低速大容量離心機，上海安亭科學儀器廠；DF101B 數(shù)顯集熱式攪拌器，金壇市大地自動化儀器廠；HP 1100 高效液相色譜系統(tǒng)（配有可二極管陣列檢測器和Rev.A.06.03 色譜工作站，美國安捷倫儀器公司）；渦流振蕩器（QL-861 型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司），水浴氮吹儀（DSY-V1 型，北京金科精華苑科技有限公司）

1.3 試驗方法

1.3.1 高效液相色譜儀的工作條件[16-17]

1） 色譜條件 色譜柱：安捷倫Eclipse plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為純甲醇，柱溫35 ℃，流速：0.8 mL/min，進樣量：10 μL，檢測波長：205，227 nm，檢測器：二極管陣列檢測器（DAD）。

2） 膽固醇的含量計算 膽固醇含量用X（mg/100 g）表示，計算公式如下：

式中，C——樣品膽固醇質(zhì)量濃度（mg/mL）；V——樣品中乙腈體積（mL）；m——量取1 mL 樣品時稱得的質(zhì)量（g）。

3） 專屬性試驗[29]取線性相關(guān)系數(shù)下的膽固醇及膽固醇氧化物的3 個標準品混合液進樣，記錄液相色譜圖。

4） 膽固醇、7-脫氫膽固醇和25-羥基膽固醇標準曲線的繪制 精密稱取100 mg 膽固醇標準品，置于100 mL 容量瓶中，用色譜級乙腈定容得到1.0 mg/mL 儲備液。精密量取儲備液1，2，4，6，8，10 mL 分別置于10 mL 容量瓶，用色譜級乙腈定容。加乙腈定容，配制成0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL，經(jīng)過濾膜（0.22 μm）后進樣。以膽固醇峰面積為縱坐標，膽固醇質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制膽固醇標準曲線。

7-脫氫膽固醇標準品溶液：精密稱取10 mg 7-脫氫膽固醇標準品，色譜級乙腈定容至10 mL得到0.5 mg/mL 的儲備液，再移取一定體積分別配制成0.01，0.02，0.05，0.10，0.15，0.20 mg/mL；經(jīng)過濾膜（0.22 μm）后進樣。以7-脫氫膽固醇峰面積為縱坐標，7-脫氫膽固醇質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制膽固醇標準曲線。

25-羥基膽固醇標準品溶液：精密稱取10 mg 7-脫氫膽固醇標準品，色譜級乙腈定容至10 mL得到0.5 mg/mL 的儲備液，再移取一定體積分別配制成0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL，經(jīng)過濾膜（0.22 μm）后進樣。以25-羥基氫膽固醇峰面積為縱坐標，25-羥基膽固醇質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制25-羥基膽固醇標準曲線。

5） 精密度 膽固醇：準確量取1 mL 牛奶，加入2 mL KOH 乙醇溶液，80 ℃皂化30 min，按上述操作，對皂化后的供試樣品重復進樣6 次。膽固醇氧化物：準確量取1 mL 成熟乳，用上述試驗條件皂化和測定，同時對該樣品重復進樣6 次，分別對色譜圖進行積分。以膽固醇和膽固醇氧化物（COPs） 的含量計算相對標準偏差 （RSD）。RSD（%）=標準偏差SD/平均值×100。

6） 回收率 準確稱取一定含量的樣品8 份，分別加入膽固醇標品0.00，0.06，0.12，0.18 mg，每個梯度做2 組平行樣；7-脫氫膽固醇：以空白作為對照組，6 組加入0.01 mg 7-脫氫膽固醇標品作為試驗組；25-羥基膽固醇：以空白作為對照組，6組加入0.02 mg 25-羥基膽固醇標品作為試驗組。按照上述方法操作，提取膽固醇，再按照上述的液相條件測定，計算回收率。

回收率計算公式如下：

7） 穩(wěn)定性 準確量取1 mL 樣品，按照上述試驗優(yōu)化得到的方法進行皂化試驗，在室溫下放置，分別在0，1，2，4，8，24 h 各進樣1 次，測定樣品中的膽固醇和COPs 的含量。

8） 重現(xiàn)性 準確稱取液體乳樣品6 份，進行皂化，通過液相色譜測定牛奶中膽固醇、膽固醇氧化物的含量。

1.3.2 膽固醇的皂化 以1 mL 牛奶作為樣品，2 mol/L KOH 乙醇溶液為皂化試劑，分別對皂化溫度：50，60，70，80，90 ℃，堿液添加量：0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL；皂化時間：10，20，30，40，50 min 3個因素進行優(yōu)化，按照上述條件反應，每隔5～10 min 振搖一下試管，使得樣品與堿液混合均勻，充分皂化。

1.3.3 膽固醇皂化物的提取和濃縮 迅速取出1.3.2 得到的皂化樣品，并用流動的冷水把樣品溫度降到常溫，加入3 mL 正己烷，充分搖勻再靜置，待樣品分層，移取上層有機相轉(zhuǎn)移到25 mL 的比色管中，再往原試管中加入6 mL 正己烷，重復萃取，把2 次分離得到的有機相集中到比色管中，水洗至中性，輕輕振蕩，防止乳化，不利于兩相的分層，上層有機相過無水硫酸鈉柱轉(zhuǎn)移至試管中。

收集到的有機相，用氮氣吹干，再向小試管中加入600 μL 的色譜級乙腈，振蕩搖勻過0.22 μm有機濾膜轉(zhuǎn)移至進樣瓶中，HPLC 待測。

1.3.4 正交試驗 以膽固醇質(zhì)量濃度為指標，以溫度（A）、時間（B）、添加量（C）和空白4 個考察因素。精密稱取樣品1 mL，共9 組，置小試管中，按照1.3.2 和1.3.3 進行試驗，按L9（34） 正交表分別進行提取，試驗設(shè)計及結(jié)果見表1。不考慮交互作用，進行方差分析，結(jié)果見表2。

1.3.5 驗證試驗 按照正交試驗的結(jié)果得到的優(yōu)化組合，進行驗證試驗。

1.3.6 統(tǒng)計分析 用SPSS20.0 對數(shù)據(jù)進行分析以及圖表繪制，檢測結(jié)果用Mean±SD 表示；所有試驗均重復3 次以上，并且用單因素方差分析比較均值，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 皂化條件的優(yōu)化

2.1.1 單因素優(yōu)化 通過單因素優(yōu)化試驗，如圖1a，2 mL 2 mol/L KOH 乙醇溶液，80 ℃條件下皂化，皂化時間達到30 min 時，皂化效果達到最大值，測得膽固醇的含量為11.968 mg/100 g。皂化時間超過30 min 后，膽固醇的含量開始下降，這可能與膽固醇部分氧化有關(guān)。GB/T 22220-2008 的皂化需要1 h，本試驗對皂化時間優(yōu)化后只需30 min，皂化時間比GB/T 22220-2008 減少一半，提高了皂化效率。如圖1b，當80 ℃下反應30 min，KOH 乙醇溶液添加量為2.0 mL 時，膽固醇含量達到最高（10.323 mg/100 g）。當堿液量繼續(xù)增加時，膽固醇的含量沒有明顯變化。GB/T 22220-2008中加入了10 mL 60% KOH 溶液和30 mL 無水乙醇[17]，所消耗的有機試劑較多，本試驗大大減少了液態(tài)樣品膽固醇皂化試劑用量，節(jié)約試劑。如圖1c，當以2 mol/L KOH 乙醇溶液為皂化試劑反應30 min，皂化溫度為80 ℃時，膽固醇的含量最大10.824 mg/100 g；當溫度達到90 ℃時，皂化效果顯著下降，可能是由于高溫導致乙醇揮發(fā)加快，皂化液中的有效成分損失，導致皂化效果下降?？紤]在皂化效果基本一致的條件下，溫度過高會導致樣品中膽固醇的氧化。

圖1 單因素優(yōu)化試驗Fig.1 Single factor optimization test

2.1.2 正交試驗 從正交試驗結(jié)果表1中可見，C因素 （R=1.916） 為主要因素，A 因素為次要因素（R=1.631），B 因素（R=10.763）作用較小，在試驗過程中的影響因素較小。從圖2的響應曲線圖得出溫度、時間、添加量3 個因素的變化趨勢，與之前單因素的試驗結(jié)果吻合。優(yōu)化水平分別為A2：80 ℃，B2：30 min，C2：2 mL；最優(yōu)的試驗組合為組4：A2B1C2（13.961 mg/100 g），試驗條件為80 ℃下加入氫氧化鉀乙醇溶液2 mL，反應20 min。

表1 L9（34）正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table1 Design and results of L9（34） orthogonal test

表2 方差分析Table2 Analysis of variance

圖2 膽固醇及膽固醇氧化物標品的液相色譜圖Fig.2 Liquid chromatography of cholesterol and cholesterol oxides

2.1.3 最佳工藝驗證試驗 準確稱取1 g 樣品，平行樣3 份，按最佳工藝條件皂化（80 ℃下加入氫氧化鉀乙醇溶液2 mL，反應20 min）、提取，膽固醇質(zhì)量濃度分別為13.872，13.798，13.921 mg/100 g，說明該皂化條件穩(wěn)定可行。

2.2 HPLC 方法驗證

2.2.1 專屬性試驗 25-脫氫膽固醇、7-脫氫膽固醇和膽固醇在液相色譜中保留時間分別為5.403，8.281，15.803。25-脫氫膽固醇和7-羥基膽固醇的分離度為18.366（R＞1.5），7-羥基膽固醇和膽固醇分離度29.778（R＞1.5）。說明25-脫氫膽固醇、7-羥基膽固醇和膽固醇的分離度很好。

2.2.2 標準曲線的繪制及線性關(guān)系 以膽固醇峰面積為縱坐標，膽固醇、25-羥基膽固醇和7-脫氫膽固醇質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制膽固醇標準曲線。膽固醇標準曲線：y=5468.3x+22.612，線性范圍0.0967～0.9959 mg/mL，R2=0.99989。7-脫氫膽固醇標準曲線為：y = 20696x - 107.75，線性范圍：0.0120～0.2011 mg/mL，R2= 0.9996；25-羥基膽固醇：標準曲線y = 3308.7x - 21.53，線性范圍：0.1237～0.1998 mg/mL，R2=0.9992。

2.2.3 精密度試驗 結(jié)果表明，牛奶中膽固醇的含量平均值為13.054 mg/100 g，RSD 為0.619%，RSD＜2%。試驗結(jié)果表明，該色譜分析條件具有很高的精密度。結(jié)果如表3所示，成熟乳中7-脫氫膽固醇平均值為0.873 mg/100 g，RSD 為3.562%，RSD＞2%，25-羥基膽固醇平均值為1.19 mg/100 g，RSD：1.696%，RSD＜2%，試驗結(jié)果表明該色譜條件定量膽固醇氧化物具有一定的精密度。

表3 膽固醇及COPs 精密度試驗結(jié)果Table3 Experimental results of cholesterol and COPs precision

2.2.4 回收率試驗 該方法膽固醇的回收率在99.2%～101.2%，平均回收率為99.5%，7-脫氫膽固醇的平均回收率為47.4%，25-羥基膽固醇的平均回收率為67.6%。說明該方法在簡便易行的基礎(chǔ)上，還能有較高的回收率，基本可以完全提取樣品中的膽固醇，準確性高，穩(wěn)定性強，樣品中的COPs含量較低，回收率相對較低?？赡苁怯捎?5-羥基膽固醇含有一個羥基，7-脫氫膽固醇中含有一個羰基。都屬于極性基團，水溶性大，不利于物質(zhì)的回收。

表4 膽固醇及COPs 回收率試驗結(jié)果Table4 Experimental results of cholesterol and COPs recovery

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 試驗結(jié)果表明，牛奶中膽固醇含量的平均值為13.470 mg/100 g，RSD：0.545%，RSD＜2%；25-羥基膽固醇含量的平均值為0.910 mg/100 g，RSD 為1.248%，RSD＜2%；7-脫氫膽固醇含量的平均值為1.088 mg/100 g，RSD：2.798%，RSD＜2%，通過該方法提取的膽固醇具有很高的穩(wěn)定性，測定膽固醇的含量基本沒有變化。25-羥基膽固醇和7-脫氫膽固醇相對于膽固醇含量有差異。

2.2.6 重現(xiàn)性試驗 結(jié)果見表6，牛奶中膽固醇的含量平均值為13.085 mg/100 g，RSD 為1.105%，RSD＜3%，該試驗結(jié)果表明本方法的重現(xiàn)性較好。7-脫氫膽固醇含量平均值為1.133 mg/100 g，RSD為1.446，RSD＜3%，25-羥基膽固醇含量平均值為0.885 mg/100 g，RSD 為5.284，RSD＞3%，結(jié)果表明該方法測定膽固醇氧化物的重現(xiàn)性較膽固醇的差，分析原因主要由于樣品中的含量太低，存在一定的差異性。

表5 膽固醇及COPs 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table5 Test results of cholesterol and COPs stability

表6 膽固醇及COPs 重現(xiàn)性試驗結(jié)果Table6 The experimental results of cholesterol and COPs reproducibility

2.3 幾種乳制品和母乳中膽固醇和膽固醇氧化物的含量

根據(jù)上述所得的膽固醇皂化和液相方法，本試驗測定了13 種品牌的奶制品，通過分析可得，13 種奶制品中伊利純牛奶中的膽固醇含量最高（13.342 mg/100 g），其 次 是 蒙 牛 純 牛 奶（12.159 mg/100 g），陽光純牛奶（11.160 mg/100 g），伊利和陽光純牛奶存在顯著性差異（P＜0.05）。母乳中，成熟乳中膽固醇的含量（9.371 mg/100 g）顯著（P＜0.05）低于初乳膽固醇含量（10.967 mg/100 g），試驗測得的母乳膽固醇含量均在文獻報道范圍內(nèi)4.30～21.77 mg/100mL[21-22]。酸奶中，陽光原味酸奶的膽固醇含量最高（10.674 mg/100 g），而蒙牛原味酸牛奶的膽固醇含量最低（8.912 mg/100 g）。結(jié)果表明，不同品牌的純牛奶之間膽固醇含量也存在一定差異，主要因為奶牛個體間差異和奶源不同等因素導致。不同品牌的酸牛奶中的膽固醇含量也存在差異，主要由于奶源差異，以及所采用菌種類型不同，不同菌種降膽固醇效果不一樣[23-27]。隨著哺乳時間變化，母乳中的膽固醇含量也發(fā)生一定變化。母乳中的膽固醇含量 （初乳10.967 mg/100g，成熟乳9.371 mg/100 g）與沖配后嬰兒配方奶中的膽固醇含量 （一段10.552 mg/100 g，二段10.718 mg/100 g，三段11.399 mg/100 g）相近，因此配方奶粉的膽固醇的添加量主要參考母乳中膽固醇的數(shù)據(jù)，更有利于嬰兒身體健康。市售的奶制品中均未檢測到膽固醇氧化物，只在母乳樣品初乳和成熟乳中分別檢測到較少量的膽固醇氧化物（COPs＜2 mg/mL），與文獻中的報道結(jié)果相符[20]，其中初乳中7-脫氫膽固醇的含量為0.395 mg/100 g，25-羥基膽固醇0.819 mg/100 g；成熟乳中的7-脫氫膽固醇的含量為0.895 mg/100 g，25-羥基膽固醇1.146 mg/100 g。且母乳中的初乳和成熟乳中的7-脫氫膽固醇含量具有顯著性差異（P＜0.05），而25-羥基膽固醇隨著泌乳期變化沒有顯著性差異。

表7 幾種奶制品和母乳中膽固醇和膽固醇氧化物的含量Table7 The content of cholesterol and oxidized cholesterol in several dairy products and human milk

3 結(jié)論

本試驗通過膽固醇的皂化時間、 溫度和皂化試劑添加量的單因素優(yōu)化試驗，以及正交試驗和驗證試驗。得到了適合液態(tài)乳膽固醇皂化最佳條件為1 mL 液態(tài)乳80 ℃下加入2.0 mL KOH 乙醇溶液皂化20 min。并且，本試驗驗證了同時測定乳中膽固醇、7-脫氫膽固醇和25-羥基膽固醇的含量的高效液相色譜法。該色譜條件下測定，膽固醇、7-脫氫膽固醇和25-羥基膽固醇的分離度分別為29.78，18.37（分離度＞1.5）。膽固醇、7-脫氫膽固醇和25-羥基膽固醇線性范圍分別為0.0967～0.9959 mg/mL （R2=0.9999）、0.0120～0.2011 mg/mL（R2=0.9996）和0.1237～0.1998 mg/mL（R2=0.9992）；平均回收率分別為99.5%，67.6%，47.4%。該方法大大的減少了皂化試劑的用量和皂化時間，節(jié)約了樣品用量，且采用液相色譜方法同時測定乳中膽固醇、7-脫氫膽固醇和25-羥基膽固醇的含量，具有較好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和回收率。