楊梅多酚提取物對高糖損傷INS-1細胞活性及Pdx-1表達的影響

戚向陽 孟 珂 章 棋 劉合生 柳云麗 喻柯柯 陳秋平 曹少謙

（浙江萬里學院生物與環(huán)境學院 浙江寧波315100）

Ⅱ型糖尿病是一種典型的代謝綜合癥，可誘發(fā)機體多種代謝異常。有研究表明，胰島β 細胞功能受損和凋亡是糖尿病發(fā)病的主要誘因[1-3]，而糖脂毒性是損傷胰島β 細胞功能的重要原因[4-5]。研究表明，高糖損傷胰島β 細胞的機制之一是抑制胰島素基因轉錄因子Pdx-1 的活性及其表達水平[6]。Pdx-1 在胰腺發(fā)育、胰島β 細胞分化及維持成熟胰島β 細胞正常功能方面起著關鍵作用，可調節(jié)胰島β 細胞葡萄糖激酶基因、 葡萄糖轉運子GLUT-2 的表達[7]。Pdx-1 表達受損可誘發(fā)高血糖及血脂異常[8]。動物實驗[9]表明，糖尿病鼠的持續(xù)高血糖可明顯抑制Pdx-1 基因和胰島素基因表達，降低Pdx-1 轉錄因子與胰島素基因啟動子結合能力，降低胰島素分泌量。此外，Pdx-1 還調控其它與胰島素分泌相關基因的表達，影響β 細胞的葡萄糖刺激的胰島素分泌功能（GSIS）及胰島素分泌時相的改變[10]。上調Pdx-1 蛋白表達，減弱INS-1細胞糖脂毒性，是保護胰島β 細胞和緩解糖尿病患者癥狀的一種有效途徑。

目前市場上降糖藥物種類繁多，可是均對人體具有一定毒副作用。有研究發(fā)現(xiàn)許多天然產物，尤其是多酚類化合物具有明顯的降血糖作用。如茶多酚可以降低餐后高血糖，調節(jié)血脂，緩解胰島素抵抗[11]。天竺桂提取物中的B-型多酚具有一定的降血糖活性，可保護棕櫚酸或H2O2誘導損傷的INS-1 細胞。楊梅花色苷能減少H2O2誘導的胰島INS-1 細胞的凋亡和壞死，減少細胞內過量ROS的產生，同時能減少自噬性細胞的死亡[12]。然而，有關楊梅多酚化合物對高濃度葡萄糖誘導的胰島β 細胞凋亡和功能受損的保護作用尚未見有關文獻。本文以胰島β 細胞INS-1 細胞作為試驗對象，探討楊梅多酚提取物對高糖誘導INS-1 細胞損傷的保護作用以及對Pdx-1 轉錄因子表達水平的影響，為天然安全的降糖功能因子的篩選提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

INS-1 細胞，上海基免實業(yè)有限公司。RPMI 1640 培養(yǎng)基，北京Hyclone 公司；β-巰基乙醇，美國Gibco 公司；丙酮酸鈉、 葡萄糖、MTT、Hoechst 33342、吖啶橙（PI）、臺盼藍及胰蛋白酶，美國Sigma 公司；胎牛血清，北京全式金生物技術有限公司；二甲亞砜（細胞培養(yǎng)級），北京索萊寶科技有限公司；青霉素-鏈霉素溶液，江蘇碧云天生物技術研究所；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、細胞與組織裂解液（P1003）、actin 抗體、Pdx-1 抗體（Cell Signaling Technology）、HRP 標記山羊抗小鼠lgG （H+L）、Anti-rabbit lgG HRP-Linked 抗 體 及30%Acr-Bis（29∶1），江蘇碧云天生物技術研究所；脫脂奶粉原產地美國；NaCl 注射液（生理鹽水）、定影粉、顯影粉、四甲基乙二胺、超敏發(fā)光液、甲醇、吐溫20、正丁醇、氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、二甲亞砜、異丙醇等，上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器及設備

CO2培養(yǎng)箱，日本三洋公司；熒光倒置顯微鏡，日本Nikon 公司；96 孔板離心機及自動混勻器，德國Eppendorf 公司；通用酶標儀，美國Thermo 公司；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 楊梅多酚提取物的制備 稱取一定量的楊梅果實，去核，以質量體積比1∶2 的比例加入丙酮溶劑，利用超聲波溶劑提取法重復提取3～4 次，至提取液顏色幾乎為白色，旋蒸去除溶劑。再以60%的乙醇水溶液為洗脫劑過LXA-8 大孔樹脂，收集洗脫液，再旋蒸去除洗脫劑，冷凍干燥得楊梅多酚粗提物粉末。其總酚含量為65.52%。

1.3.2 細胞復蘇及培養(yǎng) 取出液氮罐中凍存的胰島INS-1 細胞于37 ℃水浴中快速解凍。無菌條件下打開螺蓋，將細胞吸入無菌離心管中，加1～2 mL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，1 000 r/min 離心5 min 后棄上清液，加5 mL 培養(yǎng)液重懸，反復吹打成單細胞懸液，將細胞置于含有10%胎牛血清的INS-1 專用培養(yǎng)基中，于37 ℃，飽和濕度，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面的70%～90%時，即可以用0.125%的胰蛋白酶消化，傳代擴大培養(yǎng)。

1.3.3 MTT 法檢測INS-1 細胞活性 取一定量細胞培養(yǎng)液，在待測細胞培養(yǎng)板中每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT 溶液，37 ℃孵育4 h 至有藍紫色結晶析出，3 000 r/min 離心10 min，棄去上清液，每孔加入100 μL 二甲亞砜，400 r/min 振蕩10 min使甲瓚結晶溶解，酶標儀檢測492 nm 波長處的吸光度。按下式計算細胞成活率：

細胞成活率（%）= OD 值/OD0值×100

式中，OD——不同處理組的吸光值；OD0——對照組的吸光值。

1.3.4 Hoechst 33342/PI 雙染觀察INS-1 細胞凋亡和壞死 取一定量細胞培養(yǎng)液，棄上清液，用PBS 清洗2 次，每次3 min。分別加入500 μL 5 μg/mL Hoechst 33342 和500 μL 5 μg/mL PI 工作液，室溫孵育15 min。染色后磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2 次，每次3 min，吸棄上清，熒光顯微鏡觀察：用紫外光濾光片 （UV） 觀察Hoechst 33342 染色情況，凋亡細胞呈亮藍色熒光，正常細胞呈弱藍色熒光。用綠光濾光片（G）觀察PI 染色情況，晚期凋亡和壞死細胞呈亮紅色熒光，正常細胞呈現(xiàn)弱紅色熒光。

1.3.5 高糖及楊梅多酚提取物對胰島細胞活性的影響 取對數(shù)生長期細胞，調整細胞濃度，按1.2×104cell/孔接種于96 孔板，CO2培養(yǎng)箱中5%CO2，37 ℃培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液。分別設置對照組（CON）、不同濃度的高糖損傷組（HG 組），不同濃度的樣品組（Sample）。根據(jù)試驗分組對細胞進行干預，其中，CON 組：加入200 μL 完全培養(yǎng)基；HG組：加入200 μL 不同濃度（16，20，25，40 mmol/L）HG；Sample 組：分別加入200 μL 0.1～200 μg/mL的楊梅多酚提取物。然后置于37 ℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間，每組設3 個平行。各組細胞培養(yǎng)結束后，按MTT 法檢測INS-1 細胞活性。

1.3.6 楊梅多酚提取物對糖毒性損傷細胞活性的保護作用 分別設置對照（CON）組、高糖模型組（HG 組）、樣品（Sample）組，并根據(jù)試驗分組對細胞進行干預。CON 組：加入200 μL 完全培養(yǎng)基；HG 組：加入100 μL 50 mmol/L HG 和100 μL 完全培養(yǎng)基，使體系中HG 終濃度25 mmol/L；Sample 組：分別加入100 μL 50 mmol/L HG 和100 μL 初始質量濃度為1，2，6，10，20，40 μg/mL 楊梅多酚提取物，放置于37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每組設3 個平行。各組細胞干預結束后，按MTT 法測定INS-1 細胞活性。

1.3.7 楊梅多酚提取物對糖毒性損傷細胞凋亡和壞死的影響 取對數(shù)生長期細胞，調整細胞濃度，按2×105cell/孔接種于12 孔板，于CO2培養(yǎng)箱中5%CO2，37 ℃培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液。分別設置對照 組（CON 組）、高糖模型組（HG 組）、樣品組（Sample 組），根據(jù)試驗分組對細胞進行干預：CON組：加入2 mL 完全培養(yǎng)基；HG 組：加入1 mL 50 mmol/L HG 和1 mL 完全培養(yǎng)基，使體系最終含25 mmol/L HG；Sample 組：分別加入1 mL 50 mmol/L HG 和1 mL 初始質量濃度為1，2，6，10，20，40 μg/mL CBE。放置于37 ℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每組設3 個平行。各組損傷結束后，按Hoechst 33342/PI 雙染法觀察細胞。

1.3.8 Western blot 檢測Pdx-1 蛋白的表達 按2.7 方法進行試驗分組并對細胞進行干預，各組損傷結束后，棄上清液，用PBS 清洗2 次，每次約3 min。每孔分別加入100 μL 細胞裂解液，反復吹吸使細胞充分裂解，全部吸出，置于冰上凍融30 min，然后在4 ℃、13 000 r/min 離心30 min，離心后取上清液按BCA 試劑盒法分析蛋白質含量。

采用BIO-RAD 電泳儀進行SDS-PAGE 電泳，聚丙烯酰胺凝膠分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%，在凝膠的一端加樣孔內加入預染蛋白分子Marker，在中間各孔加入8～20 μL 蛋白樣品，每孔總蛋白上樣量保持一致，采用60 V 恒壓進行濃縮膠電泳，90 V 恒壓進行分離膠的電泳。然后通過轉印系統(tǒng)使蛋白從凝膠上轉移到硝酸纖維素膜（NC）上，置于5%脫脂奶粉中室溫封閉0.5～1 h。加一抗（小鼠Pdx-1 抗體，稀釋比例為1 ∶1 000）4℃孵育過夜后，棄一抗，用TBST 洗膜1 h。再加二抗（HRP 二抗，1 ∶1 000）室溫孵育1 h，棄二抗，用TBST 洗膜1 h。加入ECL 化學發(fā)光液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時立即放入雙蒸水中終止反應，用凝膠成像分析系統(tǒng)進行掃描分析。

2 結果與分析

2.1 高糖對INS-1 細胞活力的影響

如圖1所示，不同濃度的高糖均能顯著降低INS-1 細胞的成活率，且成活率隨高糖濃度及損傷時間的變化呈現(xiàn)出不同的變化。INS-1 細胞用16，20，25，40 mmol/L 的高糖溶液損傷36 h 后，與對照組相比，細胞活力隨著高糖濃度的升高逐漸下降。當INS-1 細胞用HG 損傷48 h 后，細胞活力分別為82.323%±2.71%，74.319%±3.209%，70.811%±3.279%，44.341%±0.918%。MTT 試驗結果證明了高糖刺激導致INS-1 細胞的活性受到抑制和影響。采用高糖濃度25 mmol/L 損傷48 h 時，細胞的損傷達到30%左右，若損傷時間進一步延長，雖然細胞活力進一步降低，但對對照組影響較大，營養(yǎng)物質的消耗會導致細胞凋亡。因此綜合試驗結果，選擇25 mmol/L，HG 損傷48 h 作為高糖模型的試驗條件。

圖1 高糖對INS-1 細胞活力的影響Fig.1 Effects of high glucose on INS-1 cell viability

2.2 楊梅多酚提取物對INS-1 細胞生長的影響

楊梅多酚提取物在0.1～20 μg/mL 范圍內對細胞生長有明顯促進作用，當提取物質量濃度高于20 μg/mL，INS-1 細胞的活性隨楊梅多酚提取物濃度的增加而逐漸降低，高濃度的楊梅多酚提取物對INS-1 細胞的生長均有明顯的抑制作用（圖2）。因此，選定質量濃度范圍為0～20 μg/mL的楊梅多酚提取物研究其對糖毒性損傷細胞活性的保護作用。

2.3 楊梅多酚提取物對高糖損傷INS-1 細胞活力的影響

如圖3所示，高糖損傷模型組細胞活性下降69.333%，在試驗的質量濃度范圍內（0.5～20 μg/mL），楊梅多酚提取物對HG 誘導損傷的INS-1 細胞均有保護作用，以質量濃度5 μg/mL 的保護效

圖2 楊梅多酚提取物對細胞活性的影響Fig.2 The effects of Chinese bayberry polyphenol extract on the INS-1 cell viability

2.4 楊梅多酚提取物對高糖誘導INS-1 細胞凋亡和壞死的影響

圖4及圖5分別表示楊梅多酚提取物對高糖誘導INS-1 細胞凋亡和壞死的影響。對照組只有極少數(shù)細胞呈現(xiàn)亮熒光，高糖損傷組被染成亮熒光的細胞數(shù)目明顯增多，不同質量濃度的楊梅多酚提取物干預組呈亮熒光的細胞數(shù)目相比HG 損傷組顯著減少。表明HG 對INS-1 細胞產生毒害作用，使正常細胞發(fā)生凋亡并進一步發(fā)展到細胞壞死，在此試驗的質量濃度范圍內 （0.5～20 μg/mL），楊梅多酚提取物的干預對HG 損傷的INS-1細胞有顯著的保護作用，以質量濃度5 μg/mL 的保護效果較好。且低、中質量濃度（0.5～5 μg/mL）楊梅多酚提取物對糖毒性誘導的INS-1 細胞凋亡及壞死的保護作用隨著CBE 質量濃度的增加保護作用增強，然而在5～20 μg/mL 范圍內，CBE 對細胞的保護作用沒有劑量-效應關系。

2.5 楊梅多酚提取物對Pdx-1 表達水平的影響

采用Western blot 試驗觀察楊梅多酚提取物處理后的Pdx-1 蛋白表達水平，如圖6所示，對比果較好，與損傷組相比，細胞活性上升了14.078%。且在低質量濃度范圍內（0.5～5 μg/mL），楊梅多酚提取物的保護作用與質量濃度之間呈劑量-效應關系，推測楊梅多酚提取物對“糖毒性” 損傷的INS-1 細胞的保護作用與楊梅多酚提取物促進細胞增殖生長作用之間存在密切聯(lián)系。HG 損傷組，在0.5～5 μg/mL 范圍內，Pdx-1 蛋白表達水平隨著楊梅多酚提取物作用濃度增加逐漸提高。前面的研究發(fā)現(xiàn)楊梅多酚提取物對HG 誘導損傷的INS-1 細胞具有顯著的保護作用，Western blot 試驗結果表明這種保護作用可能是通過上調Pdx-1 蛋白的表達，刺激胰島β 細胞的增值與分化，進而增加胰島素的分泌來實現(xiàn)的。

圖3 楊梅多酚提取物對高糖誘導INS-1 細胞損傷的影響Fig.3 The effects of Chinese bayberry polyphenol extracts on INS-1 cell injured by HG

3 結論與討論

圖4 楊梅多酚提取物對高糖誘導INS-1 細胞凋亡的影響Fig.4 The effects of Chinese bayberry polyphenol extracts on INS-1 cell apoptosis injured by HG

圖5 楊梅多酚提取物對高糖誘導INS-1 細胞壞死的影響Fig.5 The effects of Chinese bayberry polyphenol extracts on INS-1 cell necrocytosis injured by HG

圖6 Western blot 檢測Pdx-1 蛋白表達水平Fig.6 Pdx-1 protein expression levels analysis by Western blot

有研究表明糖毒性可以通過減少胰島β 細胞的數(shù)量，抑制胰島素基因的表達，來降低胰島素的合成和分泌量[13]。本試驗以大鼠胰島β 細胞系INS-1 細胞作為試驗對象，首先探討了楊梅多酚提取物對胰島細胞活性的影響，發(fā)現(xiàn)楊梅多酚提取物在0.1～20 μg/mL 質量濃度范圍內，對正常胰島細胞生長有明顯的促進作用，而高質量濃度的楊梅多酚提取物（≧20 μg/mL）對INS-1 細胞的生長有明顯的抑制作用。該結果與張波[11]研究結果一致，其研究發(fā)現(xiàn)低濃度楊梅花色苷能顯著促進INS-1 胰島細胞增殖，而高濃度則抑制細胞增殖。這是否是由于楊梅多酚化合物在INS-1 增殖過程產生有毒代謝產物還有待進一步探討。同時，本試驗還以25 mmol/L 葡萄糖損傷48 h 作為糖毒性損傷條件，模擬機體內血糖代謝紊亂導致的胰島素抵抗環(huán)境，研究楊梅多酚提取物對糖毒性造成細胞活性下降，細胞凋亡以及細胞壞死是否具有保護作用。結果表明，高糖損傷組細胞活性下降至69.3%，在所試驗的質量濃度范圍內（0.5～20 μg/mL），楊梅多酚提取物對HG 誘導損傷的INS-1 細胞有保護作用，且楊梅多酚提取物在低質量濃度（0.5～5 μg/mL）范圍內保護作用呈劑量-效應關系，與損傷組相比，5 μg/mL 楊梅多酚提取物對INS-1 細胞活性的保護作用最好，可達14%以上。熒光染色結果證實楊梅多酚提取物對高糖誘導的細胞凋亡和壞死具有保護作用，且在低質量濃度范圍內（0.5～5 μg/mL），楊梅多酚提取物對高糖誘導的INS-1 細胞凋亡和壞死的保護作用，隨質量濃度的升高而增強。同時，本研究還證實楊梅多酚提取物能顯著上調Pdx-1 蛋白的表達。有研究發(fā)現(xiàn)黃連素可通過增加細胞Pdx-1 的表達水平，改善高糖高脂對細胞的損害作用，其可能機制為上調Pdx-1 表達水平，增強胰島素、GLUT-2 基因的轉錄活性，改善胰島細胞功能[14]。據(jù)報道，紅薯葉黃酮能改善四氧嘧啶糖尿病小鼠胰腺Pdx-1的表達水平，增強胰島β 細胞的分泌胰島素能力，降低血糖[15]。也有文獻報道，胰島β 細胞數(shù)量的增多有利于增加胰島素分泌量，從而改善糖尿病的糖代謝異常[16]。結合本試驗研究結果，推測楊梅多酚化合物對HG 誘導的INS-1 細胞的保護作用可能通過上調Pdx-1 表達水平，刺激胰島β 細胞的增值與分化，增強胰島素分泌能力而實現(xiàn)。