洛克沙胂代謝物在土壤中的累積及其植物有效性研究

黃連喜，魏 嵐，姚麗賢，何兆桓，周昌敏

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，農(nóng)業(yè)部南方植物營(yíng)養(yǎng)與肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省養(yǎng)分循環(huán)利用與耕地保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，廣州 510642）

有機(jī)胂類飼料添加劑具有促進(jìn)禽畜生長(zhǎng)、殺菌、提高飼料報(bào)酬及提高禽畜色素沉積作用[1-3]。據(jù)報(bào)道，從1995年到2000年，大約70%的美國(guó)肉雞養(yǎng)殖使用洛克沙胂[4]。洛克沙胂（3-硝基-4-羥基苯胂酸，ROX）及阿散酸（對(duì)氨基苯胂酸，ASA）為我國(guó)應(yīng)用最廣泛的兩種有機(jī)胂飼料添加劑[5-6]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部第168號(hào)公告《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》規(guī)定洛克沙胂及阿散酸在豬、雞配合飼料中的用量分別為50 mg·kg-1及100 mg·kg-1。禽畜對(duì)有機(jī)胂的吸收率很低，有機(jī)胂大部分以原形隨糞尿排出[7-8]。有機(jī)胂化合物毒性較低，隨禽畜糞尿進(jìn)入環(huán)境后可經(jīng)過(guò)一系列的降解，最終轉(zhuǎn)化為其他強(qiáng)毒性的砷化合物，其代謝產(chǎn)物包括As（Ⅲ）、As（Ⅴ）、MMA、DMA、4-HPA、3-氨基-4-羥基苯胂酸（3-A-4-HPA）及其他未知的砷化合物[9-13]。由于禽畜糞便一般作為有機(jī)肥料施用于農(nóng)田，有機(jī)胂及其含砷代謝物在土壤中可被農(nóng)作物吸收累積[14-15]，最終有可能通過(guò)食物鏈被人體攝入。由于有機(jī)胂對(duì)人畜的潛在危害，日本和歐盟1999年開始明確停止洛克沙胂的生產(chǎn)，美國(guó)也從2011年開始禁止應(yīng)用洛克沙胂作為飼料添加劑。最近，我國(guó)農(nóng)業(yè)部對(duì)阿散酸（4-氨基苯胂酸）及洛克沙胂兩種有機(jī)胂飼料添加劑開展了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，已于2018年5月1日開始停止洛克沙胂的生產(chǎn)，擬于2019年5月1日起停止該兩種原料藥及各種制劑用于食品動(dòng)物。有機(jī)胂飼料添加劑除了洛克沙胂及阿散酸外，還有苯胂酸、4-羥基苯胂酸、4-硝基苯胂酸及4-脲基苯胂酸等化合物。本研究以洛克沙胂為模型，通過(guò)雞只喂飼含洛克沙胂飼料后排泄的糞便作為有機(jī)肥用于蔬菜的種植，探討有機(jī)胂代謝產(chǎn)物在土壤中的累積、殘留風(fēng)險(xiǎn)及其對(duì)農(nóng)作物有效性的影響，研究有機(jī)胂代謝產(chǎn)物通過(guò)禽畜糞便→土壤→農(nóng)作物進(jìn)入人類食物鏈的途徑，從農(nóng)業(yè)生產(chǎn)角度評(píng)估有機(jī)胂飼料添加劑的應(yīng)用及含砷代謝物雞糞作為有機(jī)肥的砷污染風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品和試劑

洛克沙胂標(biāo)準(zhǔn)品（純度為97.5%）購(gòu)于德國(guó)EhrenstorferGmbh公司，3-A-HPA（純度為99%）購(gòu)于美國(guó)Sigma-aldrich公司，4-HPA（純度為98%）購(gòu)于日本TCI公司。As（Ⅴ）（Na2HAsO4·12H2O，17.5±0.4 mg·L-1）、As（Ⅲ）（Na3AsO3，75.7 ± 1.2 mg· L-1）、MMA（CH4AsNaO3·1.5H2O，25.1±0.8 mg·L-1）及 DMA（C2H6AsNaO2·2H2O，52.9±1.8 mg·L-1）貯備液均購(gòu)于中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。所有砷貯備液置于-4℃冰箱中保存，以防砷化合物發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)化。實(shí)驗(yàn)中所用的甲醇（美國(guó)Burdick&Jachson公司）為高效液相色譜級(jí)甲醇，其他試劑均為分析純。

1.2 盆栽試驗(yàn)

供試土壤為菜園土，采自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所試驗(yàn)基地（23°8′43″N，113°20′50″E），土壤類型為赤紅壤，質(zhì)地為沙壤土。土壤經(jīng)風(fēng)干、磨碎，過(guò)2 mm篩后用作盆栽試驗(yàn)。供試的第一種雞糞（CK-CM）由喂飼不含洛克沙胂飼料的20日齡肉雞排泄產(chǎn)生，第二種雞糞（As-CM）由喂飼添加洛克沙胂飼料的20日齡肉雞排泄產(chǎn)生。兩種飼料由廣東省惠州市一家大型飼料廠生產(chǎn)提供，含洛克沙胂飼料中洛克沙胂的添加量為55 mg·kg-1。土壤及兩種雞糞的基本理化性質(zhì)見表1。蔬菜品種為茼蒿（Chrysan-themum coronarium），購(gòu)于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜種子市場(chǎng)。盆栽試驗(yàn)所選用塑料盆規(guī)格為26 cm×17 cm，每盆裝土7.5 kg，雞糞用量為盆土的2%。試驗(yàn)分為CK-CM及As-CM兩個(gè)雞糞添加處理，每個(gè)雞糞處理分3個(gè)階段采收，每個(gè)采收階段4個(gè)重復(fù)，采收時(shí)間分別為播種后第40、48、54 d。試驗(yàn)過(guò)程僅以所添加的雞糞為肥料，不額外施加其他有機(jī)無(wú)機(jī)肥料。土壤與雞糞經(jīng)充分混勻后，每公斤土中加入去離子水0.3 kg，放置老化10 d后播入茼蒿種子，發(fā)芽后，每盆留苗5株。

表1 供試土壤及雞糞的基本性質(zhì)Table 1 Basic properties of the experimental soil and chicken manures

1.3 樣品采集及前處理

飼料喂飼及雞糞收集工作于廣東省惠州市的一個(gè)大型集約化養(yǎng)雞場(chǎng)開展，雞糞收集于喂飼開始的第10 d，連續(xù)收集10 d。雞糞收集完畢后堆漚一個(gè)月，然后自然晾干，粉碎機(jī)打碎后-80℃冰箱保存，待用于分析測(cè)試及盆栽試驗(yàn)。茼蒿播種前每盆土均采集一個(gè)土壤樣本，凍干機(jī)（Alpha 1-4/LD-plus，Christ German）低溫凍干。茼蒿收獲后馬上采集每盆茼蒿的根際土壤并低溫凍干，土壤樣品利用瑪瑙研缽研磨，過(guò)100目篩，保存在-80℃冰箱，待提取及測(cè)定總砷和各砷形態(tài)化合物含量。每個(gè)生長(zhǎng)階段茼蒿收獲時(shí)均分為地上部和根系兩部分采收，先后用自來(lái)水和純水清洗，然后低溫凍干，記錄凍干前后樣品的重量，利用粉碎機(jī)（ZM200，Germany）研磨成粉末，馬上保存在-80℃冰箱，待提取及測(cè)定總砷和各砷形態(tài)化合物含量。

雞糞或土壤樣本用50%王水（1份硝酸和3份鹽酸混合均勻，純水稀釋一倍）消解，蔬菜樣本用濃硝酸、濃硫酸及高氯酸濕法消解，消解液定容后待測(cè)定總砷含量。

雞糞和土壤中的不同形態(tài)砷化合物用0.1 mol·L-1磷酸及0.1 mol·L-1磷酸二氫鈉（1∶9，V/V）混合物提取，蔬菜植株中不同形態(tài)砷化合物用超純水提取[16]。準(zhǔn)確稱取一定量（雞糞為0.2 g，土壤為1.0 g，植株為0.25 g）樣品于離心管中，加10 mL提取液，55℃浸提樣品10 h后，超聲波提取20 min，以4000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min后收集上清液，殘?jiān)偌? mL提取液反復(fù)提取2次，3次提取的上清液合并。將雞糞和土壤提取液定容為20 mL，蔬菜植株提取液凍干后定容為3 mL，定容后過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)定各砷形態(tài)化合物含量。

1.4 分析方法

總砷的測(cè)定：雞糞、土壤和蔬菜消解液中的砷首先用硫脲預(yù)還原為As（Ⅲ），接著用2.0%KBH4及5%鹽酸還原為AsH3，最后用原子熒光分光光度計(jì)（北京吉天儀器有限公司，AFS-8130）測(cè)定總砷含量。土壤成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW07408和植物成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW07602，購(gòu)買于中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，分別用來(lái)確保土壤、雞糞和蔬菜植株總砷含量的準(zhǔn)確性。

不同形態(tài)砷化合物的分離與測(cè)定：利用液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光聯(lián)用法（LC-HG-AFS）測(cè)定不同形態(tài)砷化合物含量。各種被提取出來(lái)的砷形態(tài)化合物首先由液相色譜（20AT，日本島津公司）分離，分離柱為ODS3 C18色譜柱（長(zhǎng)250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，柱填料顆粒直徑為5 μm，美國(guó)菲羅門公司）。洗脫程序?yàn)樘荻认疵?，整個(gè)過(guò)程為30 min，前11 min為100%流動(dòng)相A，11～20 min為100%流動(dòng)相B，20～30 min為100%流動(dòng)相A，流動(dòng)相流速為1.0 mL·min-1。流動(dòng)相A組成：磷酸二氫銨（NaH2PO4·2H2O）10 mmol·L-1+四丁基溴化銨（C16H36BrN，TBAB）0.5 mmol·L-1+3%甲醇（V/V），流動(dòng)相B組成：磷酸二氫銨（NaH2PO4·2H2O）50 mmol·L-1+四丁基溴化銨（C16H36BrN，TBAB）0.5 mmol·L-1+5%甲醇（V/V），A與B流動(dòng)相均用50%氨水調(diào)節(jié)pH值為6.22。不同形態(tài)砷化合物經(jīng)液相色譜完全分離后，進(jìn)入氫化物發(fā)生-原子熒光分光光度計(jì)進(jìn)行砷含量測(cè)定。砷化合物在氫化物發(fā)生器中首先與20 g·L-1過(guò)硫酸鉀充分混合發(fā)生氧化，含砷氧化物接著與20 g·L-1硼氫化鉀和10%（V/V）鹽酸發(fā)生反應(yīng)形成含砷的氫化物，最后被400 mL·min-1氬氣載流進(jìn)入原子熒光檢測(cè)器。

1.5 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)

所有樣本的測(cè)定數(shù)據(jù)均為4個(gè)重復(fù)，利用SAS/STAT軟件（SAS V9）進(jìn)行LSD方差分析及Origin 8.0軟件作圖。除非特別指出，所有樣品中砷形態(tài)化合物含量均為其中的砷元素含量。茼蒿砷化合物的吸收總量為茼蒿該形態(tài)砷化合物的含量與生物量的乘積。土壤砷形態(tài)化合物的提取率為各種砷形態(tài)化合物含量之和與總砷含量的比值。砷化合物的生物累積系數(shù)（BFs）為整盆茼蒿（地上部+地下部）中該砷形態(tài)化合物含量與土壤中該砷形態(tài)化合物含量的比值，砷化合物在植物中的轉(zhuǎn)移系數(shù)（TFs）則為茼蒿地上部該砷形態(tài)化合物含量與地下部該砷形態(tài)化合物含量的比值，而茼蒿對(duì)砷化合物的吸收率為茼蒿地上部與地下部砷化合物吸收總量之和與播種前土壤該砷化合物總量的比值，As-CM中砷化合物的植物有效性為As-CM與CK-CM處理茼蒿中該形態(tài)砷化合物吸收總量的差值與所添加As-CM中該形態(tài)砷化合物總量的比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 砷形態(tài)化合物的液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光聯(lián)用檢測(cè)

圖1 砷形態(tài)化合物的液相-氫化物發(fā)生-原子熒光分析圖譜Figure 1 Liquid chromatography-hydride generation-atomic fluorescence spectrometry of As species

如圖 1A 所示，As（Ⅲ）、DMA、MMA、3-A-4-HPA、As（Ⅴ）、4-HPA及洛克沙胂7種砷標(biāo)準(zhǔn)化合物在30 min內(nèi)能達(dá)到完全分離。氫化物發(fā)生-原子熒光光譜對(duì)As（Ⅲ）、DMA、MMA、3-A-4-HPA、As（Ⅴ）、4-HPA及洛克沙胂的檢出限分別為1.8、3.6、1.9、12.1、4.7、3.8、9.5 μg·L-1。雞糞、土壤及茼蒿樣品中7種砷標(biāo)準(zhǔn)化合物的加標(biāo)回收率分別為82.4%±1.3%～96.0%±2.1%、81.4%±2.4%～105.6%±3.9%、83.3%±3.2%～103.2% ±3.3%、45.8% ±1.9%～60.3% ±2.7%、93.1%±3.1%～99.1%±2.9%、94.6%±2.9%～103.3%±6.0%和85.3%±1.3%～104.1%±3.7%。利用優(yōu)化的液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光聯(lián)用方法對(duì)供試雞糞（圖1B及圖1C）、土壤（圖1D）以及采收的茼蒿植株（圖1E及圖1F）進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，CK-CM中只檢測(cè)出As（Ⅲ）、DMA及As（Ⅴ）3種砷形態(tài)化合物，As-CM中則檢測(cè)出As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（Ⅴ）、4-HPA、洛克沙胂及少量未知形態(tài)砷形態(tài)化合物，基礎(chǔ)土壤及茼蒿地下部檢測(cè)出As（Ⅲ）及As（Ⅴ）兩種砷形態(tài)化合物，而茼蒿地上部?jī)H檢出As（Ⅲ）一種砷形態(tài)化合物。

2.2 洛克沙胂代謝物在土壤中的殘留及累積

圖2 播種前及3個(gè)生長(zhǎng)階段茼蒿采收后CK-CM和As-CM處理的土壤中砷形態(tài)化合物組成及含量Figure 2 As species in soil amended with CK-CM and As-CM before the vegetable sown stage and after the three vegetables harvested stages

如圖2所示，2%CK-CM處理的土壤中可提取的As（Ⅲ）及 As（Ⅴ）含量分別為 116.2±5.1 μg·kg-1及1 529.5±40.6 μg·kg-1，而2%As-CM添加使土壤中可提取的As（Ⅲ）及As（Ⅴ）含量分別顯著（P＜0.05）提升為173.2±8.2 μg·kg-1及2 039.3±27.3 μg·kg-1，并可檢測(cè)出少量DMA，其在土壤中的含量為55.5±2.3 μg·kg-1。40、48 d及54 d茼蒿收獲后，添加CK-CM的土壤中可提取的As（Ⅲ）含量分別為53.3±4.7、51.0±2.3 μg·kg-1及 46.7±2.0 μg·kg-1，而 As（Ⅴ）含量分別為1 109.6±4.7、1 087.7±23.0 μg·kg-1及957.7±16.4 μg·kg-1。由此可知，由于蔬菜對(duì)土壤中砷化合物的吸收累積及土壤本身在干濕交替環(huán)境下對(duì)砷化合物的吸附固持，種植茼蒿后土壤中可提取的As（Ⅲ）及As（Ⅴ）含量均比播種前有所下降，且隨著茼蒿的生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而降低。添加As-CM的土壤中可提取的As（Ⅲ）含量分別為 63.6±1.5、60.1±2.2 μg·kg-1及 49.0±2.4 μg·kg-1，As（Ⅴ）含量分別為1 307.4±15.6、1 264.0±42.1 μg·kg-1及1 069.7±35.8 μg·kg-1，DMA在3個(gè)階段茼蒿采收后的土壤中均未被測(cè)出。該結(jié)果表明，茼蒿種植前As-CM處理土壤中可提取的As（Ⅲ）及As（Ⅴ）比 CK-CM 處理土壤顯著（P＜0.05）提升49.1%±4.4%及33.4%±2.3%。40、48 d及54 d茼蒿采收后，As-CM處理土壤中可提取的As（Ⅲ）含量仍然比CK-CM處理土壤提高20.0%±1.2%（差異顯著，P＜0.05）、18.1%±4.2%（差異顯著，P＜0.05）和4.9%±1.0%（差異不顯著），As-CM處理土壤中可提取的As（Ⅴ）含量仍然比CK-CM處理土壤提高18.0%±4.7%（差異顯著，P＜0.05）、16.2%±2.2%（差異顯著，P＜0.05）和11.7%±2.4%（差異不顯著）。

2.3 洛克沙胂代謝物對(duì)茼蒿地上部及地下部生物量的影響

不同時(shí)期茼蒿生物量（表2）結(jié)果顯示，與添加CK-CM處理相比較，含洛克沙胂代謝物雞糞極顯著提高3個(gè)不同采收時(shí)期茼蒿地上部生物量（P＜0.01），而對(duì)地下部生物量沒有明顯的影響（P=0.5617）。此外，添加兩種雞糞處理的茼蒿地上部與地下部生物量均隨著茼蒿生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而極顯著提高（P＜0.01）。

表2 3個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期茼蒿生物量（鮮質(zhì)量，g·pot-1）Table 2 Biomass of Chrysanthemum coronarium at the three growth stages（fresh weight，g·pot-1）

2.4 茼蒿地上部及地下部砷化合物含量及吸收總量

如表3所示，3個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期苘蒿地下部均能檢測(cè)出As（Ⅲ）和As（Ⅴ）兩種砷形態(tài)化合物，而地上部則僅檢測(cè)出As（Ⅲ）一種砷化合物。盡管所有處理中茼蒿可食用的地上部As（Ⅲ）及總砷含量均沒有超出中華人民共和國(guó)GB 2762—2012國(guó)標(biāo)中規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)，但與CK-CM處理相比，土壤中添加As-CM顯著（P＜0.05）提高茼蒿地上部As（Ⅲ）及地下部As（Ⅲ）、As（Ⅴ）含量。在3個(gè)不同的生長(zhǎng)階段，土壤中添加As-CM處理的茼蒿地上部As（Ⅲ）含量比CK-CM處理分別提高13.8%±0.4%、16.6%±1.1%及37.4%±6.5%，而地下部As（Ⅲ）含量比CK-CM處理分別提高123.2%±6.5%、112.9%±4.5%及117.0%±8.4%，地下部As（Ⅴ）含量則比CK-CM處理分別提高44.4%±2.6%、71.9%±3.3%及78.0%±5.1%。無(wú)論是CK-CM處理還是As-CM處理的土壤中，茼蒿可食用的地上部As（Ⅲ）含量均隨著生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著提升，但茼蒿地下部的As（Ⅲ）含量則隨著茼蒿生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。砷形態(tài)化合物的提取率結(jié)果表明，茼蒿地上部As（Ⅲ）的平均提取率為77.6%±6.0%，而地下部As（Ⅲ）與As（Ⅴ）的提取率為74.2%±5.7%。該結(jié)果說(shuō)明茼蒿地上部及地下部仍有一些結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的未知砷形態(tài)化合物沒有被提取或檢測(cè)出。

由于不同雞糞處理對(duì)茼蒿生物量的影響，圖3繼續(xù)利用砷化合物的吸收總量來(lái)衡量As-CM與茼蒿砷吸收累積的關(guān)系。與CK-CM處理相比，土壤中添加As-CM顯著（P＜0.05）提高茼蒿地上部As（Ⅲ）、地下部的As（Ⅲ）和地下部As（Ⅴ）的吸收總量，且茼蒿可食用的地上部As（Ⅲ）、地下部As（Ⅲ）及地下部As（Ⅴ）的吸收總量均隨著生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著提升。該結(jié)果與苘蒿地上部As（Ⅲ）、地下部As（Ⅲ）及地下部As（Ⅴ）含量變化趨勢(shì)相一致。與CK-CM處理相比，土壤中添加As-CM處理的茼蒿地下部As（Ⅲ）吸收總量在3個(gè)不同生長(zhǎng)階段分別提高78.0%±7.2%、114.5%±8.9%及106.8%±3.2%，地下部As（Ⅴ）吸收總量分別提高45.0%±8.4%、73.1%±11.2%及68.5%±8.7%，而茼蒿的可食用地上部As（Ⅲ）吸收總量則分別提高41.8%±4.6%、76.6%±10.2%及83.5%±7.5%。因此，假如食用含As-CM土壤中種植的茼蒿，將攝入比食用相同量CK-CM處理茼蒿更多的毒性As（Ⅲ）。

2.5 洛克沙胂代謝物對(duì)茼蒿中砷形態(tài)化合物吸收、傳遞及分布規(guī)律的影響

圖4利用砷的生物累積系數(shù)（BFs）和轉(zhuǎn)移系數(shù)（TFs）來(lái)分別評(píng)估茼蒿對(duì)砷形態(tài)化合物的吸收及茼蒿將砷形態(tài)化合物從地下部向地上部的輸送能力，以及探討As-CM影響下砷的BFs和TFs的變化趨勢(shì)。如圖4A所示，3個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期，CK-CM處理的茼蒿植株As（Ⅲ）的BFs值分別為0.55±0.08、0.57±0.12和0.65±0.06，添加As-CM處理的茼蒿植株As（Ⅲ）的BFs值分別為0.64±0.07、0.65±0.06和0.93±0.10。與CK-CM處理相比，添加洛克沙胂代謝物雞糞可提高茼蒿植株As（Ⅲ）的BFs值。而圖4B結(jié)果也顯示，添加As-CM也可提高茼蒿植株As（Ⅴ）的BFs值。茼蒿植株As（Ⅲ）及As（Ⅴ）的BFs結(jié)果說(shuō)明，雞糞中洛克沙胂代謝物的植物有效性比CK-CM處理雞糞高，但無(wú)顯著性差異。此外，CK-CM處理和As-CM處理的茼蒿As（Ⅲ）及As（Ⅴ）的BFs值均隨茼蒿生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而提升，差異性不顯著。如圖4C所示，3個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期CK-CM處理的茼蒿植株As（Ⅲ）的TFs值分別為0.12±0.01、0.20±0.03和0.29±0.03，添加As-CM處理的茼蒿植株As（Ⅲ）的TFs值分別下降到0.06±0.00、0.11±0.01和0.18±0.01。與CK-CM處理相比，添加As-CM處理顯著降低了茼蒿植株As（Ⅲ）的TFs值。同時(shí)，圖4C結(jié)果也顯示，所有處理的As（Ⅲ）的TFs值隨著茼蒿生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著提升。

表3 茼蒿地上部及地下部砷形態(tài)化合物及總砷含量（鮮樣，μg·kg-1）Table 3 As species total As contents in shoots and roots of Chrysanthemum coronarium（fresh weigh，μg·kg-1）

茼蒿對(duì)砷化合物的吸收累積及運(yùn)輸轉(zhuǎn)移必定導(dǎo)致砷化合物在茼蒿各部位的不同分配。表4為茼蒿地上部As（Ⅲ）、地下部As（Ⅲ）及地下部As（Ⅴ）的百分含量。茼蒿地上部As（Ⅲ）百分含量為36.7%～47.0%、地下部As（Ⅲ）百分含量為35.4%～55.1%，而地下部As（Ⅴ）百分含量為8.2%～17.6%，作為毒性最強(qiáng)的砷形態(tài)化合物，As（Ⅲ）在茼蒿植株中的百分含量高達(dá)82.4%～91.8%。表4結(jié)果也表明，As（Ⅲ）在茼蒿地上部的百分含量隨著茼蒿生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，而在根部的As（Ⅲ）百分含量則隨著茼蒿生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，另外，As-CM處理的茼蒿地下部As（Ⅲ）百分含量比CK-CM處理高，而地上部As（Ⅲ）百分含量則比CK-CM處理低，但所有處理間差異性不顯著。這種現(xiàn)象是由于不同雞糞處理及生長(zhǎng)時(shí)間茼蒿根部對(duì)As（Ⅲ）的吸收累積能力及茼蒿根部將As（Ⅲ）輸送轉(zhuǎn)移到地上部的能力差異造成的。

圖3 3個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期兩種雞糞處理茼蒿地上部及地下部砷形態(tài)化合物吸收總量Figure 3 Uptake amount of As species in shoots and roots of Chrysanthemum coronarium at the three growth stages treated with CK-CM and As-CM

圖4 3個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期兩種雞糞處理茼蒿砷形態(tài)化合物的生物累積系數(shù)和轉(zhuǎn)移系數(shù)Figure 4 Bioaccumulation factors and transfer factors of As species in Chrysanthemum coronarium at three growth stages

表4 3個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期茼蒿不同部位砷形態(tài)化合物的分布Table 4 Distribution of As species in Chrysanthemum coronarium of three growth time

2.6 洛克沙胂代謝物的植物有效性

CK-CM處理的土壤中可提取的As（Ⅲ）有0.23%±0.02%、0.32%±0.01%和0.37%±0.02%分別被40、48 d及54 d生長(zhǎng)期茼蒿吸收，而As-CM處理的土壤中可提取的As（Ⅲ）有0.25%±0.03%、0.41%±0.05%和0.51%±0.08%分別被40、48 d及54 d生長(zhǎng)期茼蒿吸收。添加洛克沙胂代謝物雞糞后，茼蒿對(duì)土壤中As（Ⅲ）的吸收率比對(duì)CK-CM處理平均提高25.8%。添加CK-CM土壤中可提取的As（Ⅴ）有0.001 7%±0.000 1%、0.004 5%±0.001 1%和0.006 4%±0.000 9%分別被40、48 d及54 d生長(zhǎng)期茼蒿吸收，而添加As-CM土壤中可提取的As（Ⅴ）有0.001 9%±0.000 1%、0.005 9%±0.001 3%和0.006 5%±0.000 8%分別被40、48 d及54 d生長(zhǎng)期茼蒿吸收，添加洛克沙胂代謝物雞糞后，茼蒿對(duì)土壤中As（Ⅴ）的吸收率比對(duì)CK-CM處理平均提高14.3%。經(jīng)計(jì)算，在40、48 d及54 d生長(zhǎng)期后，雞糞中洛克沙胂代謝物中的As（Ⅲ）的茼蒿植物有效性分別為0.31%±0.00%、0.65%±0.01%及0.79%±0.02%，而As（Ⅴ）的茼蒿植物有效性分別為0.003 1%±0.000 1%、0.013%±0.001% 及 0.017%±0.002%。因此，含洛克沙胂代謝物雞糞中的As（Ⅲ）和As（Ⅴ）植物有效性高于土壤。

3 討論

目前，低毒的有機(jī)胂類飼料添加劑通過(guò)禽畜消化排泄后轉(zhuǎn)化為強(qiáng)毒性有機(jī)無(wú)機(jī)砷化合物，并通過(guò)禽畜糞便→土壤→農(nóng)作物途徑進(jìn)入人類食物鏈的相關(guān)研究還較少。另外，我國(guó)又是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，傳統(tǒng)上把禽畜糞當(dāng)作優(yōu)質(zhì)有機(jī)肥大量施用，加上我國(guó)農(nóng)業(yè)復(fù)種指數(shù)高，禽畜糞肥用量通常高于國(guó)外同類有機(jī)肥的用量水平，因此，開展有機(jī)胂類代謝物環(huán)境行為及作物有效性的研究非常必要。研究表明，禽畜糞便的管理和儲(chǔ)存方式?jīng)Q定了砷化合物的形態(tài)[8]，有機(jī)胂在新鮮干雞糞中以原型穩(wěn)定存在，經(jīng)堆漚后，禽畜糞便中約90%有機(jī)胂在前23 d內(nèi)轉(zhuǎn)化為As（Ⅴ），38 d后全部降解。本試驗(yàn)以洛克沙胂為研究模型，發(fā)現(xiàn)飼用洛克沙胂雞只排泄的雞糞經(jīng)過(guò)堆漚后絕大部分洛克沙胂降解轉(zhuǎn)化為As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（Ⅴ）及4-HPA等有機(jī)無(wú)機(jī)含砷代謝物，含量最高的砷化合物為As（Ⅴ）。本研究中洛克沙胂及其代謝物的提取率不高，CKCM中可提取的砷形態(tài)化合物含量總和為2.7 mg·kg-1，提取率僅為30.3%，而As-CM中可提取的已知形態(tài)砷化合物含量總和為30.2 mg·kg-1，提取率約為51.8%。相關(guān)的研究也表明，在含無(wú)定形鐵氧化物和針鐵礦土壤及在低pH條件下，用磷酸鹽作提取劑只能提取18%的As（Ⅲ）、45%的As（Ⅴ）、59%的MMA、67%的ROX和88%的DMA[17]。As-CM中含有As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（Ⅴ）及4-HPA等有機(jī)無(wú)機(jī)含砷代謝物，而蔬菜中只檢測(cè)出As（Ⅲ）及As（Ⅴ）兩種無(wú)機(jī)砷化合物，說(shuō)明無(wú)機(jī)形態(tài)As（Ⅲ）及As（Ⅴ）更容易被蔬菜吸收累積。有研究[18-20]表明，添加洛克沙胂代謝物土壤中種植的蔬菜均沒有檢測(cè)出洛克沙胂、二甲基胂、一甲基胂及4-羥基苯胂酸等有機(jī)形態(tài)砷化合物，說(shuō)明蔬菜對(duì)有機(jī)形態(tài)砷化合物的吸收效率遠(yuǎn)低于無(wú)機(jī)形態(tài)砷化合物。洛克沙砷對(duì)小麥的毒性及累積特性研究也表明，砷在有機(jī)體內(nèi)的移動(dòng)性及毒性為無(wú)機(jī)砷＞有機(jī)胂[21]。3個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期茼蒿地上部及地下部砷形態(tài)化合物的組成結(jié)果說(shuō)明茼蒿根部可從土壤中吸收As（Ⅲ）和As（Ⅴ）兩種砷化合物，而只有部分As（Ⅲ）可從根部傳輸?shù)降厣喜?。該結(jié)果與前期的一些研究結(jié)果[22-23]是相符合的，植物根部對(duì)As（Ⅲ）與As（Ⅴ）的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)具有不同的途徑，As（Ⅲ）的吸收傳遞與植物內(nèi)部的水通道蛋白相關(guān)，對(duì)As（Ⅴ）的吸收傳遞則與植物內(nèi)部的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)。相關(guān)的研究[10，24]顯示，禽畜糞便中水溶性砷高達(dá)70%～75%，這意味著洛克沙胂代謝物對(duì)植物的有效性較高。有機(jī)胂飼料添加劑對(duì)豬場(chǎng)周圍及農(nóng)田環(huán)境污染的調(diào)查研究表明[25]，大型豬場(chǎng)周圍農(nóng)田土壤砷含量遠(yuǎn)高于背景值，種植的甘薯和水稻砷含量與土壤砷含量正相關(guān)。研究[26]表明雞糞中洛克沙胂的代謝產(chǎn)物As（Ⅴ）、As（Ⅲ）及DMA均可被蘿卜及生菜吸收累積，且作物不同部位砷吸收累積量隨雞糞用量的增加而升高。研究[27]結(jié)果表明，長(zhǎng)期施用以雞糞為原料的有機(jī)肥可導(dǎo)致重金屬（主要為砷、鉛和鉻）在蔬菜地表層土壤中積累，增加土壤及蔬菜重金屬污染風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果也表明，施用含洛克沙胂代謝物雞糞顯著提高茼蒿地上部As（Ⅲ）、地下部As（Ⅲ）及地下部As（Ⅴ）含量，且添加含洛克沙胂代謝物雞糞的土壤在茼蒿采收后其可提取的As（Ⅲ）及As（Ⅴ）仍然比對(duì)照雞糞處理提高。因此，假如含洛克沙胂代謝物雞糞繼續(xù)作為有機(jī)肥應(yīng)用于同一土壤的下一茬蔬菜中，更高含量的砷化合物將殘留于土壤中，殘留的As（Ⅲ）和As（Ⅴ）將會(huì)繼續(xù)影響下一茬或者以后更多茬次蔬菜對(duì)砷化合物的吸收及累積。

4 結(jié)論

（1）洛克沙胂經(jīng)雞只排泄后最終被降解轉(zhuǎn)化為As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（Ⅴ）及4-HPA等有機(jī)無(wú)機(jī)形態(tài)砷化合物，As（Ⅴ）為最主要的形態(tài)。

（2）與洛克沙胂、二甲基胂、一甲基胂及4-HPA等有機(jī)形態(tài)砷化合物相比，無(wú)機(jī)形態(tài)As（Ⅲ）及As（Ⅴ）更容易被茼蒿吸收累積，其中As（Ⅲ）是茼蒿植株內(nèi)最主要的砷形態(tài)化合物。

（3）施用含洛克沙胂代謝物雞糞顯著提高茼蒿地上部As（Ⅲ）、地下部As（Ⅲ）及地下部As（Ⅴ）含量，所有處理的茼蒿可食用的地上部As（Ⅲ）及總砷含量均低于我國(guó)規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)。

（4）施用含洛克沙胂代謝物雞糞的土壤在茼蒿采收后其可提取的As（Ⅲ）及As（Ⅴ）仍然高于對(duì)照雞糞處理，含有機(jī)胂代謝物雞糞連續(xù)施用的土壤砷累積風(fēng)險(xiǎn)不可忽視。

（5）茼蒿對(duì)添加含洛克沙胂代謝物雞糞的土壤中As（Ⅲ）及As（Ⅴ）吸收比對(duì)照雞糞處理提高25.8%及14.3%，因此有機(jī)胂代謝物雞糞中砷化合物的植物有效性較高。