N,N'-二乙酰胱氨酸對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化的保護(hù)作用

葉堅(jiān)虹 王福根 繆樑斌 席建軍 孫晶晶

肝纖維化是各種形式的慢性肝損傷病情發(fā)展的共同病理基礎(chǔ)，是肝臟細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）的合成與降解失衡導(dǎo)致過(guò)度沉積的結(jié)果，如未得到有效治療，肝纖維化將最終發(fā)展為肝硬化、肝細(xì)胞癌等[1]。近年來(lái)，對(duì)肝纖維化的研究主要從抗病毒、抑制肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）活化和增殖、促進(jìn)ECM的降解、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞因子的表達(dá)等方面進(jìn)行[2-3]。N-乙酰半胱氨酸（NAC）具有良好抗氧化功能，對(duì)肝纖維化具有較好的治療作用[4-5]。N,N′-二乙酰胱氨酸（N,N′-diacetylcystine，DiNAC）是 NAC第2代產(chǎn)品，具有理化性質(zhì)穩(wěn)定、毒性較低、藥效強(qiáng)等特點(diǎn)[6-7]。本研究通過(guò)皮下注射四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）制備肝纖維化模型，觀察DiNAC治療大鼠肝纖維化的療效，并探討其可能的機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠90只，體重200～220（210±10）g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（浙）2014-0008。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)籠子內(nèi)，實(shí)驗(yàn)條件為濕度（55±5）%，溫度（22±2）℃，白天和晚上各 12h循環(huán)，實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲食飲水。

1.2 試劑與儀器 DiNAC（江蘇正大天晴藥業(yè)有限公司）；二硫氨基甲酸肽吡咯烷（PDTC，上海碧云天生物技術(shù)研究所）；CCl4（上海凌峰化學(xué)試劑公司）；肝功能血清學(xué)和肝組織各指標(biāo)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；7060型全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）；MAX190型紫外-可見(jiàn)連續(xù)光譜酶標(biāo)儀（美國(guó)分子儀器公司）；Beckman Allegra X-22R型離心機(jī)（美國(guó)貝克曼公司）；XW-80A旋渦振蕩器（上海青浦瀘西儀器廠）；Leica2235輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；OlympasB41顯微鏡（日本Olympas公司）。

1.3 動(dòng)物造模及給藥 采用隨機(jī)數(shù)字表法將90只大鼠分成正常組、模型組、DiNAC低劑量組、DiNAC中劑量組、DiNAC高劑量組、PDTC組（作為陽(yáng)性對(duì)照）6組，每組15只。正常大鼠不作任何處理，其余5組大鼠以50%CCl4溶液（用橄欖油稀釋）為造模劑，按1ml/kg劑量皮下注射，2次/周，連續(xù)10周；第2周起，DiNAC低、中、高劑量組大鼠按 12.5、25、50mg/kg腹腔注射DiNAC，PDTC組大鼠按100mg/kg腹腔注射PDTC，1次/d，連續(xù)8周。稱重1次/周，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)節(jié)給藥劑量。

1.4 標(biāo)本采集 于末次給藥后16h，用3%戊巴比妥鈉（0.15ml/100g）腹腔注射麻醉后處死，75%乙醇溶液消毒腹部后開(kāi)腹，腹腔靜脈采血，3 000rmp離心15min后，吸取血清，置-80℃保存，用于肝功能和肝纖維化指標(biāo)備用測(cè)定。取肝組織2.0g用10%中性甲醛固定，用于病理等檢查；另取肝組織5.0g用液氮預(yù)凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于肝組織丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定。

1.5 血清肝功能指標(biāo)測(cè)定 使用全自動(dòng)生化分析儀（7060型，日本日立公司）測(cè)定AST、ALT、ALP等指標(biāo)。

1.6 血清肝纖維化指標(biāo)測(cè)定 采用ELISA法測(cè)定血清中Ⅳ型膠原（CⅣ）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）。

1.7 肝組織MD含量和SOD活性測(cè)定 從液氮中取出保存的肝組織，精確稱量肝組織1.0g，制成10%組織勻漿，3000rmp，離心10min，取上清液，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定肝組織MDA含量，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性，操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.8 肝組織病理學(xué)檢查 取大鼠肝組織，常規(guī)脫水后石蠟包埋，切片，HE染色和網(wǎng)狀纖維染色，觀察各組大鼠肝組織脂肪變性、炎癥、肝纖維化程度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠一般情況 正常組大鼠毛色光澤，行走正常。模型組大鼠毛色無(wú)光澤，行走左右搖晃、甚至不能站立；其余各組大鼠毛色光澤度較好，行走搖晃較模型組輕。

2.2 DiNAC對(duì)大鼠血清肝功能指標(biāo)的影響 與正常組大鼠比較，模型組大鼠AST、ALT和ALP水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），說(shuō)明CCl4造模10周，大鼠肝細(xì)胞受到損傷。與模型組比較，DiNAC不同劑量組和PDTC組大鼠的AST、ALT和ALP水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），提示兩種藥物對(duì)大鼠肝纖維化均有一定治療作用，見(jiàn)表1。

表1 DiNAC對(duì)各組大鼠血清肝功能指標(biāo)的影響（U/L）

2.3 DiNAC對(duì)大鼠血清肝纖維化指標(biāo)的影響 與正常組比較，模型組大鼠CⅣ、PCⅢ水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與模型組比較，DiNAC中、高劑量組和PDTC組大鼠血清CⅣ、PCⅢ水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），DiNAC低劑量組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 DiNAC對(duì)各組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)的影響

2.4 DiNAC對(duì)肝組織MDA含量和SOD活性的影響 與正常組比較，模型組大鼠肝組織MDA含量升高、SOD活性降低（P＜0.05）。與模型組比較，藥物治療組能升高SOD活性，降低MDA水平（P＜0.05），且呈劑量依賴性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DiNAC能改善肝纖維化大鼠肝組織抗氧化作用，見(jiàn)表3。

表3 DiNAC對(duì)各組大鼠肝組織MDA含量和SOD活性的影響

2.5 DiNAC對(duì)肝纖維化大鼠肝組織結(jié)構(gòu)的影響

2.5.1 HE染色 正常組大鼠的肝臟組織細(xì)胞形態(tài)正常，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈排列整齊，未見(jiàn)肝細(xì)胞脂肪變性、炎癥和壞死（圖1a）；模型組的大鼠肝細(xì)胞排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞嚴(yán)重脂肪變性，出現(xiàn)大量的炎癥和壞死肝細(xì)胞（圖1b）；DiNAC不同劑量組和PDTC組脂肪變性的肝細(xì)胞減少，可見(jiàn)中等或小面積的炎癥和點(diǎn)灶狀壞死肝細(xì)胞，炎癥反應(yīng)明顯減輕（圖1c-f）。

圖1 各組大鼠肝組織HE染色所見(jiàn)（a：正常組；b：模型組；c：DiNAC 低劑量組；d：DiNAC 中劑量組；e：DiNAC 高劑量組；f：PDTC 組；HE 染色，×100）

2.5.2 網(wǎng)狀纖維染色 正常組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)完整，視野下基本無(wú)纖維增生，僅在少許主要血管周圍見(jiàn)少量纖維（圖2a）；模型組大鼠肝纖維化嚴(yán)重，膠原纖維增生明顯增多，一些區(qū)域假小葉形成（圖2b）。DiNAC不同劑量組和PDTC組肝組織纖維沉積減少，未見(jiàn)明顯假小葉形成（圖 2c-f）。

圖2 各組大鼠肝組織染色所見(jiàn)（a：正常組；b：模型組；c：DiNAC低劑量組；d：DiNAC 中劑量組；e：DiNAC 高劑量組；f：PDTC 組；網(wǎng)狀纖維染色，×100）

3 討論

肝纖維化是各種慢性疾病在發(fā)展過(guò)程中，肝臟內(nèi)膠原增生、分解失調(diào)使過(guò)多膠原沉積所導(dǎo)致。有研究證實(shí)氧化應(yīng)激在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8-9]。當(dāng)肝臟受到多種損傷性因子刺激后，產(chǎn)生過(guò)多的活性氧，從而導(dǎo)致氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡，引起肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞損傷，釋放大量的細(xì)胞因子、炎癥因子，誘發(fā)炎癥細(xì)胞在肝臟內(nèi)浸潤(rùn)。炎癥反應(yīng)誘發(fā)HSC的活化和增殖，活化的HSC合成和分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，最終導(dǎo)致過(guò)多ECM在肝臟沉積，促進(jìn)肝纖維化的形成和發(fā)展[10]。皮下注射CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化是經(jīng)典模型之一，CCl4經(jīng)肝臟細(xì)胞色素P450代謝成三氯甲基自由基導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞壞死，從而激活Kupffer細(xì)胞，產(chǎn)生大量炎癥因子，誘發(fā)纖維化的形成[11-12]。故本實(shí)驗(yàn)采用50%CCl4作為造模劑并獲得成功。

血清有關(guān)指標(biāo)可反映肝臟基本功能，常用于評(píng)價(jià)肝纖維化發(fā)生情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清AST、ALT和ALP水平升高，說(shuō)明肝細(xì)胞受到損傷；DiNAC不同劑量組和PDTC組大鼠血清AST、ALT和ALP水平降低，說(shuō)明DiNAC和PDTC對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷具有較好的保護(hù)作用。反映肝纖維化的血清學(xué)指標(biāo)主要包括層黏蛋白、透明質(zhì)酸、CⅣ和PCⅢ[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DiNAC中、高劑量組和PDTC治療組大鼠血清CⅣ和PCⅢ水平均降低，提示DiNAC對(duì)大鼠肝纖維化具有一定的治療效果。結(jié)合光鏡下肝組織病理學(xué)檢查，進(jìn)一步證實(shí)了DiNAC能夠改善大鼠肝纖維化程度。在肝纖維化的防治中，抗氧化治療是重要的環(huán)節(jié)。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中產(chǎn)生的主要產(chǎn)物，體內(nèi)MDA含量可反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，從而間接反應(yīng)機(jī)體氧化應(yīng)激的水平。SOD是一種抗氧化活性物質(zhì)，可清除自由基及過(guò)氧化物，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，減少肝臟細(xì)胞損傷[14]。前期研究表明，DiNAC對(duì)半乳糖胺引起的大鼠急性肝功能衰竭具有較好的治療作用，可降低血清MDA和一氧化氮含量，其機(jī)制是DiNAC干擾了硫氧還原蛋白、蛋白二硫化異構(gòu)體酶等靶蛋白，從而抑制了氧自由基對(duì)細(xì)胞膜或線粒體的損傷[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同劑量DiNAC和PDTC均能提高肝臟中SOD活性，降低MDA含量，抗氧化應(yīng)激可能是DiNAC抗肝纖維化的作用機(jī)制之一。

綜上所述，通過(guò)CCl4誘導(dǎo)大鼠建立肝纖維化模型，采用DiNAC干預(yù)肝纖維化大鼠，能使大鼠血清肝功能指標(biāo)得到改善，肝纖維化膠原指標(biāo)明顯下降，肝組織病理變化也明顯減輕，這一結(jié)果表明DiNAC可抑制肝纖維化的發(fā)展，具有保護(hù)肝臟的作用，其具體機(jī)制還需深入研究。