蘆丁對D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠認(rèn)知功能的保護(hù)作用研究

石茜 何守玉 霍麗霞 徐永強(qiáng) 王翔

衰老是一個(gè)漸進(jìn)緩慢的過程，常見的相關(guān)性疾病有帕金森病（PD）和阿爾茨海默?。ˋD）。據(jù)報(bào)道，活性氧（ROS）的產(chǎn)生與抗氧化酶活性之間的不平衡導(dǎo)致的氧化損傷在衰老過程中起關(guān)鍵作用[1]。蘆丁是許多傳統(tǒng)中草藥中常見的黃酮類化合物，具有顯著的抗氧化特性[2-3]和抗炎活性[4]，已證明蘆丁可對6-羥基多巴胺（6-OHDA）誘導(dǎo)的PD樣和A-β42誘導(dǎo)的AD樣損傷具有保護(hù)作用[3]。但蘆丁在衰老引起的認(rèn)知功能下降中的作用和機(jī)制很少有報(bào)道。維生素E很早就被證明是親脂類自由基的清除劑，在神經(jīng)保護(hù)方面發(fā)揮重要作用[5]。黃榕祥等[6]證明維生素E可通過抗氧化作用保護(hù)海馬神經(jīng)元，改善衰老大鼠空間認(rèn)知功能。因此在本研究中，筆者利用維生素E作為陽性對照,利用D-半乳糖（公認(rèn)的衰老模型誘導(dǎo)劑[7]）構(gòu)建小鼠衰老模型，研究蘆丁對衰老小鼠認(rèn)知功能的保護(hù)機(jī)制，以期為衰老引起的認(rèn)知功能障礙提供新的治療和預(yù)防思路。

1 材料和方法

1.1 試劑 蘆丁、D-半乳糖和維生素E（美國Sigma公司）；尼氏染色試劑盒（中國碧云天公司）；總超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（NOS）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；一抗：兔微管相關(guān)蛋白-2（MAP-2）抗體（美國 Millipore公司，1∶200）、抗半胱天冬酶-3（Caspase-3）抗體（美國 Bioworld 公司，1∶200）和鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）抗體（美國Millipore公司，1∶600）；二抗：羊抗兔 IgG（重鏈+輕鏈）（美國 Bioworld公司，1∶200）;羊抗鼠超敏二步法（polink-2）加聚合物（北京中山金橋公司）。

1.2 動(dòng)物和藥物處理 雄性ICR小鼠80只，體重18～22g，均購自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)前這些動(dòng)物適應(yīng)本實(shí)驗(yàn)室環(huán)境1周。所有流程均已通過南通大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與利用委員會(huì)和江蘇省動(dòng)物保護(hù)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[批準(zhǔn)文號(hào)：SYXK（SU）2007-0021]。

1.2.1 動(dòng)物分組及模型構(gòu)建 衰老小鼠評(píng)價(jià)指標(biāo)中，SOD活力降低是最重要的參考指標(biāo)[8]，目前給藥劑量無統(tǒng)一規(guī)定，一般 50～500mg·kg-1·d-1不等，連續(xù) 6～8 周即可構(gòu)建小鼠衰老模型[9]。本研究采用直接抽取法將小鼠分成對照組、D-半乳糖組、D-半乳糖+蘆丁組和D-半乳糖+維生素E組，每組20只，其中8只用于T-SOD、GSH-PX活性檢測和MDA水平測定，8只用于NOS活性和NO水平檢測，4只用于制作多個(gè)腦組織冷凍切片，進(jìn)行海馬神經(jīng)元計(jì)數(shù)及MAP-2等指標(biāo)檢測。對照組接受每日皮下注射0.9%氯化鈉注射液和0.5%羧甲基纖維素鈉注射液（與非水溶性藥物粘合乳化，利于藥物溶水）。D-半乳糖組小鼠每日皮下注射D-半乳糖（100 mg/kg），口服0.5%羧甲基纖維素鈉懸液6周。D-半乳糖+蘆丁組小鼠每日皮下注射D-半乳糖（100mg/kg），口服含蘆丁（25mg/kg）的0.5%羧甲基纖維素鈉懸液6周。D-半乳糖+維生素E組小鼠每日皮下注射D-半乳糖（100 mg/kg），口服含維生素 E（25mg/kg）的 0.5%羧甲基纖維素鈉懸液6周。

1.2.2 Morris水迷宮測試 經(jīng)過6周的治療后，在水迷宮中評(píng)估所有小鼠的空間學(xué)習(xí)能力，該裝置由長、寬、深分別為73、42、20cm的黑色有機(jī)玻璃矩形罐組成。容器包括1個(gè)起點(diǎn)，1個(gè)終端平臺(tái)和4個(gè)無平臺(tái)設(shè)施。在水迷宮中填充水深12cm，溫度控制在（22±1）℃。在訓(xùn)練的第1天，讓每只老鼠停留在終端平臺(tái)上30s以識(shí)別該位置，并將其放置在面對泳池墻的水中，在第1個(gè)起始點(diǎn)包含無平臺(tái)設(shè)施，記錄每次試驗(yàn)找到終端平臺(tái)的逃避潛伏期。如果在2min內(nèi)找不到梯子，游泳時(shí)間被定為2min。小鼠連續(xù)6d接受試驗(yàn)。對于所有的試驗(yàn)，通過計(jì)算機(jī)化的視頻成像分析系統(tǒng)（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院材料醫(yī)學(xué)研究所）測量并計(jì)算6d內(nèi)所有小鼠的逃避潛伏期、游泳距離和游泳路徑。

1.2.3 生化指標(biāo)檢測 在最后1次行為測試后24h進(jìn)行生化指標(biāo)檢測。每組16只小鼠通過斷頭處死，小心地去除大腦并用冰冷的等滲氯化鈉溶液沖洗。海馬在冷氯化鈉溶液中制備成100g/L勻漿，用于測定T-SOD、GSH-Px和NOS活性以及MDA、NO含量。所有檢查均按說明進(jìn)行。

1.3 海馬區(qū)神經(jīng)元損傷情況檢測 采用甲酚紫染色法。對海馬神經(jīng)元進(jìn)行染色，顯微鏡（德國Leica公司，DM4000顯微鏡）下觀察，計(jì)算海馬CA1區(qū)域中陽性細(xì)胞的數(shù)量（0.27mm2）。測量4對雙側(cè)腦組織切片，計(jì)算每對腦切片陽性細(xì)胞數(shù)平均值，并將該值用于進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 免疫組化染色 對于MAP-2標(biāo)記，將腦組織切片在四乙基若丹明異硫氰酸酯（TRITC）偶聯(lián)的羊抗兔IgG中孵育，用于觀測海馬神經(jīng)元樹突完整性情況；對于Caspase-3和GFAP標(biāo)記，切片用羊抗鼠polink-2加聚合物溫育，分別用于觀測海馬神經(jīng)元凋亡情況與星型膠質(zhì)細(xì)胞損傷情況。用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)拍攝海馬CA1和頂葉皮層的照片（德國Leica公司，DM4000B顯微鏡）。計(jì)算海馬中陽性細(xì)胞的數(shù)量（Caspase-3為0.07mm2，GFAP為0.27mm2）。測量4對雙側(cè)腦切片，計(jì)算每對腦切片陽性細(xì)胞平均值，并將該值用于進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graphpad 5.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠逃避潛伏期、游泳距離和游泳路徑比較 與對照組比較，在訓(xùn)練的第5、6天時(shí)D-半乳糖組逃避潛伏期與游泳距離均延長（均P＜0.05）；與D-半乳糖組比較，在訓(xùn)練的第5、6天時(shí)D-半乳糖+蘆丁組與D-半乳糖+維生素E組逃避潛伏期與游泳距離均縮短（均P＜0.05）見圖1a和b。圖1c顯示了第2、6天試驗(yàn)中4組小鼠的游泳路徑，與訓(xùn)練2d比較，4組小鼠訓(xùn)練6d游泳到達(dá)終端平臺(tái)的路徑明顯縮短。

圖1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測實(shí)驗(yàn)各組小鼠認(rèn)知功能（a：4組小鼠的逃避潛伏期比較；b：4組小鼠的游泳距離比較；與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 D- 半乳糖組比較，△P＜0.05；c：在第 2天和第6天的試驗(yàn)中小鼠的代表性游泳路徑）

2.2 4組小鼠海馬中抗氧化酶活性和氧化產(chǎn)物水平比較 與對照組比較，D-半乳糖組小鼠海馬中MDA水平增加（P＜0.05），T-SOD和GSH-Px的活性均明顯降低（均P＜0.01）；與D-半乳糖組比較，D-半乳糖+蘆丁組小鼠海馬中T-SOD、GSH-Px活性均被逆轉(zhuǎn)恢復(fù)（均P＜0.05），MDA 水平明顯降低（P＜0.01）；D-半乳糖+維生素E組小鼠海馬中T-SOD和MDA水平活性均被逆轉(zhuǎn)恢復(fù)（均P＜0.05），但對降低的GSH-Px活性沒有產(chǎn)生任何明顯影響，見表1。

表1 蘆丁對D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠海馬中T-SOD，GSH-Px和MDA水平的影響

2.3 4組小鼠海馬神經(jīng)元損傷情況 與對照組比較，D-半乳糖組小鼠腦組織切片甲酚紫染色顯示海馬CA1區(qū)有明顯損傷并伴神經(jīng)元丟失，完整神經(jīng)細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.01）；與D-半乳糖組比較，D-半乳糖+蘆丁組與D-半乳糖+維生素E組小鼠腦組織切片染色顯示海馬CA1區(qū)的損傷及神經(jīng)元丟失情況均有所好轉(zhuǎn)，完整神經(jīng)細(xì)胞數(shù)均增加（均P＜0.05），見圖2（插頁）和表2。

表2 鼠腦海馬CA1區(qū)完整神經(jīng)細(xì)胞數(shù)（個(gè)）

2.4 4組小鼠海馬神經(jīng)元凋亡情況 與對照組比較，D-半乳糖組小鼠海馬中凋亡陽性細(xì)胞明顯增加（P＜0.01）；與D-半乳糖組比較，D-半乳糖+蘆丁組與D-半乳糖+維生素E組小鼠海馬中凋亡陽性細(xì)胞均明顯減少（均P＜0.05），見圖 3（插頁）和表 3。

表3 鼠腦海馬CA1區(qū)Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)（個(gè)）

2.5 4組小鼠海馬神經(jīng)元樹突完整性比較 與對照組比較，D-半乳糖組小鼠的頂葉皮質(zhì)和海馬CA1神經(jīng)元的樹突變短且丟失；與D-半乳糖組比較，D-半乳糖+蘆丁組與D-半乳糖+維生素E組中未檢測到類似的破壞，見圖4（插頁）。

圖4 鼠腦中頂葉皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)樹突分支和結(jié)構(gòu)的觀察（a～d：4組小鼠頂葉皮質(zhì)神經(jīng)樹突結(jié)構(gòu)；e～h：4組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)樹突結(jié)構(gòu)；MAP-2免疫組織化學(xué)染色，×100）

圖5 鼠腦海馬區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷情況（a：對照組；b：D-半乳糖組；c：D-半乳糖+蘆丁組；d：D-半乳糖+維生素E組；GFAP免疫組織化學(xué)染色，×100）

2.6 4組小鼠海馬中的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷情況 與對照組比較，D-半乳糖組小鼠海馬中損傷腫脹的星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP信號(hào)增強(qiáng)（P＜0.01），細(xì)胞釋放總NO水平和NOS活性均明顯增加（均P＜0.01）；與D-半乳糖組比較，D-半乳糖+蘆丁組海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP信號(hào)較低（P＜0.05），NOS活性和NO水平均明顯降低（均P＜0.01），同時(shí)D-半乳糖+維生素E組小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞中NOS活性和NO水平均表現(xiàn)出相似的降低趨勢（均P＜0.05），見圖 5（插頁）、表 4、5。

表4 GFAP陽性細(xì)胞數(shù)（個(gè)）

表5 蘆丁對D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠海馬星型膠質(zhì)細(xì)胞中NOS和NO釋放的影響

3 討論

蘆丁對神經(jīng)的保護(hù)作用已被大量研究報(bào)道，其在認(rèn)知功能上的良好效果也逐漸被人們所了解，由于蘆丁和/或其代謝物有穿過血腦屏障的能力，它被證明可以改變認(rèn)知以及神經(jīng)退行性疾病的各種行為癥狀，對阿爾茲海默病具有一定的治療潛力[10]。此外，也有研究證明蘆丁對1型糖尿病引起的認(rèn)知功能障礙也有緩解作用[11]，然而，蘆丁在衰老引起的認(rèn)知功能減退中的作用很少有報(bào)道。本研究中，筆者首先驗(yàn)證了D-半乳糖（100mg/kg）處理小鼠6周后，其在Morris水迷宮中的性能顯著下降，而長期口服蘆丁合并D-半乳糖處理的小鼠逃避潛伏期和游到平臺(tái)的距離顯著降低和縮短，表明蘆丁具有改善由D-半乳糖誘導(dǎo)的認(rèn)知缺陷的潛力。

本研究也明確地證明蘆丁可以抑制神經(jīng)元丟失，抑制海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，從而提高D-半乳糖處理小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。甲酚紫染色顯示蘆丁對海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用，防止D-半乳糖誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元丟失和細(xì)胞凋亡。軸突和樹突的完整性對于ChAT運(yùn)輸是重要的[12]。在這項(xiàng)研究中，筆者檢測了MAP-2的表達(dá)以觀察含或不含蘆丁的D-半乳糖處理的小鼠中的樹突變化。筆者發(fā)現(xiàn)在D-半乳糖處理的小鼠的頂葉皮層和海馬區(qū)域中MAP-2陽性樹突具有顯著的損傷。蘆丁處理后，樹突比D-半乳糖處理的小鼠更加完整，并且這種樹突完整性可能在中樞膽堿能系統(tǒng)和認(rèn)知功能中起重要作用。

根據(jù)衰老的自由基理論，正常代謝生物氧化副產(chǎn)物ROS能導(dǎo)致大分子的氧化損傷，并隨著年齡增長引起細(xì)胞功能障礙并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在本研究中，我們觀察到D-半乳糖引起小鼠的海馬中T-SOD和GSH-Px內(nèi)源抗氧化酶活性的顯著失活，MDA（作為度量細(xì)胞或組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物）含量增加。而蘆丁能提高D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠的抗氧化能力，這與其他報(bào)道一致[13]。這些發(fā)現(xiàn)表明蘆丁在一定程度上通過改善抗氧化防御系統(tǒng)的活性來消除因D-半乳糖引起的ROS超載。

星形細(xì)胞足突，作為血腦屏障的組成部分，在維持腦微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞是血流中ROS的第1道防線，其結(jié)構(gòu)和功能改變可影響“神經(jīng)膠質(zhì)小體”的完整性并導(dǎo)致嚴(yán)重后果。星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的腦衰老有關(guān)，累積標(biāo)志物為GFAP。本研究顯示受D-半乳糖誘導(dǎo)的持續(xù)氧化應(yīng)激的影響，小鼠中血管周圍星形細(xì)胞足突腫脹，結(jié)構(gòu)和功能被破壞，GFAP陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加，這些受損的星形膠質(zhì)細(xì)胞通過上調(diào)NOS表達(dá)而產(chǎn)生NO，其水平也相應(yīng)增加。從星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的大量NO是神經(jīng)毒性的，它通過多種信號(hào)途徑導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，在此基礎(chǔ)上，星形膠質(zhì)細(xì)胞衍生的NO可能在這種衰老模型的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[14]。然而，本研究證明蘆丁或維生素E的長期治療逆轉(zhuǎn)了D-半乳糖引起的NOS活性和NO水平的升高，表明蘆丁對腦損傷的保護(hù)作用可能與氧化應(yīng)激的減弱有關(guān)。

總之，這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，D-半乳糖誘導(dǎo)的模擬衰老和認(rèn)知功能障礙與氧化應(yīng)激的增加和由此引發(fā)的凋亡級(jí)聯(lián)導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元的損傷相關(guān)。蘆丁通過抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和保持樹突完整性，改善抗氧化防御系統(tǒng)的活性，緩解星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷來發(fā)揮明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，從而增強(qiáng)小鼠的認(rèn)知能力。雖然確切的潛在機(jī)制仍不清楚，但本研究結(jié)果表明蘆丁可能在腦老化期間具有積極作用。