脆性組氨酸三聯(lián)體和鼠雙微體蛋白2蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表達及意義

張春霆 林英立 徐旻 劉冉錄 徐勇

膀胱尿路上皮癌與多種癌基因及抑癌基因異常表達有關，脆性組氨酸三聯(lián)體基因（fragile histidine triad gene，F(xiàn)HIT）在多種腫瘤組織中呈陰性表達[1-3]。鼠雙微體2蛋白基因（murine doubleminute proteingene 2，MDM2）表達增高可抑制類胰島素樣生長因子2的mRNA結合蛋白質（p62蛋白），以促進細胞惡性轉化和惡性腫瘤細胞的增殖[4-5]。筆者通過對FHIT和MDM2蛋白在Oncomine腫瘤數(shù)據(jù)庫查詢比對后，發(fā)現(xiàn)在膀胱尿路上皮癌中FHIT蛋白表達下降與MDM2蛋白表達增高密切相關，且FHIT蛋白表達下降及MDM2蛋白表達增高與膀胱腫瘤預后存在相關性。但FHIT和MDM2蛋白在膀胱尿路上皮癌中的相關性尚未見報道，本研究對FHIT和MDM2蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表達情況進行研究，探討兩種蛋白之間及其與膀胱尿路上皮癌臨床病理特征的相關性。

1 對象和方法

1.1 對象 選取金華市人民醫(yī)院（44例）、徐州市腫瘤醫(yī)院（9例）、浙江大學金華醫(yī)院（10例）和天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院（9例）2009至2017年接受手術的膀胱尿路上皮癌患者的標本共72例，以及金華市人民醫(yī)院（32例）、浙江大學金華醫(yī)院（10例）正常膀胱尿路上皮組織共42例。術前均無放化療及膀胱灌注史。72例患者中，男 42例，女 30 例，年齡 32～77（62.0±5.5)歲。納入標準：再次經病理檢查證實為膀胱尿路上皮癌,無其他部位腫瘤；分期臨床資料完整，術前均未進行全身和膀胱灌注化療、放療和免疫治療。分化程度為Ⅰ級47例，Ⅱ～Ⅲ級25例；分期（根據(jù)2002年國際抗癌聯(lián)盟的TNM分期標準）為：Tis～T1期 38 例，T2～T4期 34 例；無淋巴結轉移 54例，有淋巴結轉移18例；有吸煙史38例，無吸煙史34例。

1.2 方法 鼠抗人FHIT蛋白（工作濃度1:100，規(guī)格：100μg，批號：BS6237）及鼠抗人 MDM2 蛋白（工作濃度1:150，規(guī)格：200μg，批號：abs130145）單克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺色試劑盒均購于福建邁新生物技術有限公司。組織常規(guī)石蠟包埋，以4μm厚度連續(xù)切片6張，分別作HE染色和免疫組化染色；免疫組化染色方法按說明書操作進行，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照，用已知FHIT、MDM2蛋白陽性切片作為陽性對照；由兩位病理科醫(yī)師讀片以保證準確性。

1.3 結果判定 每張切片在高倍鏡下選定5個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，共計數(shù)500個細胞中腫瘤細胞的百分比，參照免疫組化半定量評分標準進行染色百分數(shù)評分：陽性細胞百分數(shù)＜50%時FHIT蛋白染色結果為（-），陽性細胞百分數(shù)≥50%時FHIT蛋白染色結果為（+）；MDM2蛋白染色結果判定同上。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率法，相關性分析采用Spearman等級相關。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FHIT和MDM2蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表達 FHIT蛋白表達定位于胞質,呈棕黃色顆粒狀；MDM2蛋白在正常組織中不表達，陽性表現(xiàn)為細胞核、胞質內出現(xiàn)棕黃色顆粒。兩種蛋白在Ⅰ級和Ⅱ～Ⅲ級膀胱尿路上皮癌中的表達見圖1a、b。

圖1 兩種蛋白在Ⅰ和Ⅱ～Ⅲ級膀胱尿路上皮癌中的表達（a：FHIT在Ⅲ級膀胱尿路上皮癌中表達；b：MDM2在Ⅰ級膀胱尿路上皮癌中表達；免疫組化染色，×200）

2.2 FHIT和MDM2蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表達及與臨床病理特征的關系 FHIT蛋白在膀胱尿路上皮癌中的陰性表達率為58.3%，在正常膀胱尿路上皮中為4.8%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。有吸煙史的FHIT蛋白陰性表達率為86.84%，無吸煙史的為29.41%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。FHIT蛋白陰性表達率與膀胱尿路上皮癌分化程度、TNM分期、淋巴結轉移、腫瘤大小、吸煙、年齡均有關（均P＜0.05），而與性別無關（P＞0.05）。MDM2蛋白在膀胱癌中陽性表達率為63.89%，在正常膀胱尿路上皮中為7.69%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。MDM2蛋白陽性表達與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結轉移、腫瘤大小、吸煙均有關（均P＜0.05），與年齡、性別均無關（均P＞0.05），見表 1。

2.3 FHIT與MDM2蛋白在膀胱尿路上皮癌中表達的相關性 FHIT與MDM2蛋白的表達呈負相關（r＝-0.816，P＜0.05），見表 2。

表1 FHIT和MDM2蛋白與膀胱尿路上皮癌臨床病理特征之間的關系[例（%）]

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)膀胱尿路上皮癌的演化和進展是多步驟、多階段、多基因參與的[6]，F(xiàn)HIT基因在膀胱尿路上皮癌中的陰性表達與膀胱尿路上皮癌預后相關[7-10]，MDM2有促進腫瘤細胞增殖、侵襲的生物學作用，使腫瘤細胞獲得更強的轉化和惡變能力，而FHIT和MDM2蛋白在膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展過程中是否有相關性，未見報道。

在膀胱尿路上皮癌早期，F(xiàn)HIT蛋白陰性表達率明顯上升、甲基化可能是因素之一[11-12]。本研究中72例膀胱尿路上皮癌組織FHIT蛋白陰性表達率58.33%，42例癌旁正常膀胱尿路上皮組織FHIT蛋白陰性表達率為4.76%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義，F(xiàn)HIT蛋白陰性表達與膀胱尿路上皮癌患者年齡、吸煙、TNM分期、淋巴結轉移及分化程度均有關，與性別無關，這也證明了FHIT是容易受到外界干擾而突變的基因，年齡也可能影響FHIT基因突變；Stein等[13]實驗表明，煙草致癌物增加了染色體脆性部位的表達導致FHIT基因陰性表達，這結果在本研究發(fā)現(xiàn)FHIT蛋白在膀胱尿路上皮癌中表達下降得到了證實，在對吸煙和非吸煙患者FHIT蛋白表達情況研究發(fā)現(xiàn)，吸煙者FHIT蛋白陰性表達率（86.84%）明顯高于非吸煙者（29.41%），推斷煙草類等環(huán)境致癌物可能影響FHIT蛋白表達，煙草類物質導致FHIT異常可能是膀胱尿路上皮癌中的頻發(fā)事件，其異常表達與膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展有關。FHIT蛋白隨分化程度的降低,陰性表達率有增高的趨勢；FHIT蛋白陰性表達使腫瘤增殖能力及侵襲性逐漸增加[14]。伴隨著FHIT蛋白表達的異常，MDM2蛋白也出現(xiàn)異常表達，研究表明激活p62基因能誘導MDM2基因的轉錄，轉錄后MDM2蛋白又使p62蛋白失活、降解，限制p62增高表達，從而保持細胞內MDM2/p62穩(wěn)定[15]。MDM2陽性表達可以抑制p62，本研究中MDM2蛋白在膀胱尿路上皮癌中陽性表達率為63.89%，正常膀胱尿路上皮為7.14%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義，提示MDM2蛋白也是膀胱尿路上皮癌發(fā)生中的重要因素，MDM2蛋白陽性表達率與膀胱尿路上皮癌組織的TNM分期、淋巴結轉移、分化程度、腫瘤大小、吸煙有關，與性別及年齡無關，MDM2蛋白在膀胱尿路上皮癌中是否有相同的作用機制，有待進一步研究證實；本研究對FHIT和MDM2蛋白作單邊相關性分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HIT蛋白陰性表達與MDM2蛋白陽性表達相關，兩者呈負相關，提示在膀胱尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展中兩者可能起協(xié)同作用。

FHIT蛋白陰性表達有利于腫瘤的發(fā)生和進展，MDM2蛋白的陽性表達促進腫瘤侵襲和轉移，聯(lián)合檢測上述兩項指標，可為判斷膀胱癌的惡性程度及轉移潛能作重要參考。