異甘草素預(yù)處理對老齡大鼠術(shù)后認(rèn)知功能及BDNF通路的影響

吳艷瓊 許先成 孫艷玲 昌睿杰 李清

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD）是老年患者術(shù)后常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為焦慮、人格改變、學(xué)習(xí)記憶受損等[1-2]。POCD嚴(yán)重影響患者術(shù)后生活質(zhì)量，甚至增加遠(yuǎn)期病死率[3]，且確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚，如何防止也缺乏有效手段。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）及其受體酪氨酸激酶B(tropomyosin receptor kinase B，TrkB)信號通路能調(diào)控神經(jīng)元增殖與分化、突觸可塑性、神經(jīng)遞質(zhì)釋放等，在丙泊酚所致POCD中扮演重要角色[4]。異甘草素（lsoliquiritigenin，ISL）是從甘草中提取的一種黃酮類物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化[5]、抗神經(jīng)元凋亡[6]、改善學(xué)習(xí)記憶等作用[7]。本研究旨在觀察ISL預(yù)處理對老齡大鼠術(shù)后認(rèn)知功能及BDNF通路的影響，以進(jìn)一步探討該疾病的發(fā)病機(jī)制和防治方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 SPF級健康雄性老齡SD大鼠54 只，18～20 月齡，體重 500～600g，均由湖北醫(yī)藥學(xué)院動物實驗中心提供，并經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為對照組（C組）、手術(shù)組（S組）、ISL+手術(shù)組（P組），每組18只。

1.2 試劑與設(shè)備 ISL由湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)部提供（天津馬克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號:GC-20120203，規(guī)格：20mg）；Western blot試劑盒（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號:G2003）；BDNF、TrkB 抗體（中國 biosharp公司，批號:BL003A）；肌動蛋白（β-actin）抗體（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號:GB1101）；Morris水迷宮設(shè)備（上海欣軟科技有限公司，型號：XR-XM101）。

1.3 Morris水迷宮實驗 參照文獻(xiàn)[8]，3組大鼠于術(shù)前5d進(jìn)定位航行實驗，訓(xùn)練4次/d，將水迷宮宮體均分為4個象限，水溫維持25℃左右，將逃生平臺固定于第1象限，位于水下0.7cm處，保持平臺周圍參照物恒定，通過懸于水池上方攝像頭對大鼠活動進(jìn)行圖像分析處理。將大鼠置于平臺上適應(yīng)30s，之后將大鼠從4個象限隨機(jī)放入水中，記錄大鼠入水到站于平臺上所需時間，即為逃避潛伏期；記錄大鼠從入水至找到平臺游過的路線長度為總路程，即為游泳距離。若大鼠60s仍未找到平臺，則將其引至平臺，在平臺停留10s，然后進(jìn)行下一次訓(xùn)練。取術(shù)前5d測試結(jié)果的平均值作為術(shù)前值，分別于術(shù)后 1、3、7d再次行水迷宮實驗，記錄大鼠逃避潛伏期和游泳距離。

1.4 動物模型制備 采用10%水合氯醛腹腔注射（0.3ml/100g）麻醉大鼠，在其失去翻正反射后仰臥位固定大鼠，清潔消毒腹部皮膚，于肋下0.5cm處沿腹中線作一約3cm左右的縱向切口，每5min進(jìn)行一次腹腔探查術(shù)（包括肝、胃、小腸、大腸），總手術(shù)時間20min，探查完成后關(guān)閉腹腔[9]。C組麻醉后不進(jìn)行手術(shù)，S、P組行剖腹探查術(shù)；P組于手術(shù)前連續(xù)5d給予15mg/kg的ISL灌胃（0.5g ISL溶于0.9%氯化鈉溶液100ml），C、S組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。

1.5 Western blot法檢測海馬區(qū)BDNF、TrkB蛋白表達(dá) 分別于術(shù)后 1、3、7d水迷宮實驗結(jié)束后，采用隨機(jī)數(shù)字表法取其中6只大鼠處死，分離海馬組織，將腦組織進(jìn)行勻漿研磨；加入蛋白裂解液，充分裂解離心后取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳；電泳分離后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將膜轉(zhuǎn)至含封閉液的平皿中，封閉2h；加入BDNF及TrkB一抗，室溫孵育2h；TBST緩沖液洗膜3次、每次5min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2h；洗膜3次、每次5min，將膜置入顯影液，充分接觸并顯影，采用成像分析系統(tǒng)對顯影膠片進(jìn)行分析與掃描。以目的蛋白條帶與內(nèi)參（β-actin）條帶吸光度值的比值反映BDNF、TrkB蛋白的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；水迷宮實驗數(shù)據(jù)術(shù)后各時點比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠各時點逃避潛伏期比較 與術(shù)前比較，S、P組大鼠術(shù)后各時點逃避潛伏期均明顯延長（均P＜0.01）；與C組比較，S、P組術(shù)后各時點逃避潛伏期均明顯延長（均P＜0.01）；與S組比較，P組術(shù)后各時點逃避潛伏期均明顯縮短，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表 1。

表1 3組大鼠各時點逃避潛伏期比較（s）

2.2 3組大鼠各時點游泳距離比較 3組大鼠術(shù)前游泳距離比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與術(shù)前比較，S、P組大鼠術(shù)后各時點游泳距離明顯延長；與C組比較，S、P組大鼠術(shù)后各時點游泳距離明顯延長；與S組比較，P組大鼠術(shù)后各時點游泳距離明顯縮短，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表2。

2.3 BDNF、TrkB蛋白表達(dá)量比較 與C組比較,術(shù)后各時點S、P組BDNF、TrkB蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05）；與S組比較，術(shù)后各時點P組BDNF、TrkB蛋白表達(dá)量增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表3、圖 1。

表2 3組大鼠各時點游泳距離比較（cm）

表3 3組大鼠各時點海馬區(qū)BDNF、TrkB蛋白表達(dá)量比較

圖1 3組大鼠各時點海馬區(qū)BDNF、TrkB蛋白表達(dá)的電泳圖（n=6）

3 討論

以往對POCD的相關(guān)研究多集中于心臟手術(shù)，近年來研究發(fā)現(xiàn)，在非心臟手術(shù)患者中POCD的發(fā)病率高達(dá)40%～50%，隨著人口老齡化的增加，POCD的發(fā)生率亦隨之增高，因此預(yù)防及治療POCD具有重要的臨床意義。本實驗通過剖腹探查術(shù)建立傷害性刺激模型，結(jié)果表明與C組比較，S、P組小鼠術(shù)后認(rèn)知功能明顯降低，證實手術(shù)引起的傷害性刺激參與POCD的發(fā)生。

現(xiàn)代藥理表明，甘草除具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用外，還具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[10]。ISL為甘草中有效成分之一，在神經(jīng)保護(hù)方面主要有抗缺血再灌注損傷[11]、抗氧化[12]、改善學(xué)習(xí)及記憶能力等作用[13]。詹春等[14]發(fā)現(xiàn)ISL可改善小鼠腦缺血再灌注損傷所致學(xué)習(xí)記憶障礙、改善異常腦血流及腦組織能量代謝,在腦缺血再灌注腦損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。因此本實驗通過大鼠相關(guān)行為學(xué)指標(biāo)檢測，深入探討ISL預(yù)處理對于大鼠術(shù)后認(rèn)知功能的影響。

Morris水迷宮常作為神經(jīng)退行性疾病動物模型研究方法之一，用于評估學(xué)習(xí)認(rèn)知和空間記憶等行為學(xué)，且檢測老年動物認(rèn)知功能減低較為敏感[15]。本研究于術(shù)前5d進(jìn)行定位航行實驗，顯示各組逃避潛伏期及游泳距離差異無統(tǒng)計學(xué)意義，證實在給予ISL預(yù)處理后，對于正常大鼠認(rèn)知能力未見明顯影響。術(shù)后1、3、7d，與S組比較，P組逃避潛伏期和游泳距離明顯縮短，表明ISL預(yù)處理對于術(shù)后大鼠認(rèn)知功能下降有一定的改善作用。

BDNF是由神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞合成和分泌的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白,它對參與情感和認(rèn)知功能的關(guān)鍵腦區(qū)回路中的神經(jīng)元的生存、生長和維持起著至關(guān)重要的作用[16]。BDNF與細(xì)胞膜上的TrkB受體特異性結(jié)合后,可以通過激活下游信號分子促進(jìn)促進(jìn)神經(jīng)元增殖與凋亡等,參與認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)[17]。研究發(fā)現(xiàn)敲除BDNF基因的小鼠，其TrkB蛋白表達(dá)明顯下降，小鼠學(xué)習(xí)能力出現(xiàn)障礙[18]。BDNF信號通路參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中認(rèn)知功能障礙的發(fā)生與發(fā)展,且使用TrkB激動劑激活BDNF-TrkB信號通路后,認(rèn)知功能得到改善。已被證實BDNF的表達(dá)受傷害性刺激影響，炎癥因子（IL-6、IL-1β等）可以抑制神經(jīng)細(xì)胞BDNF的合成和表達(dá)。阿爾茲海默癥模型中證實，ISL能有效抑制上述炎性因子的生成，上調(diào)BDNF表達(dá)[19]。因此本實驗預(yù)測ISL可通過抑制炎癥作用調(diào)控BDNF-TrkB信號通路，改善術(shù)后認(rèn)知功能。實驗結(jié)果證實了該假說，通過對海馬區(qū)BDNF、TrkB蛋白含量進(jìn)行了相關(guān)檢測，顯示與S組比較，P組大鼠術(shù)后各時點海馬區(qū)BDNF、TrkB蛋白表達(dá)水平明顯增加，提示ISL能夠有效增強(qiáng)BDNF-TrkB信號通路的活化，改善老齡大鼠術(shù)后的認(rèn)知功能。

本實驗僅對創(chuàng)傷性刺激所致的POCD進(jìn)行了相關(guān)研究，未進(jìn)行BDNF-TrkB信號通路上、下游基因檢測，也未進(jìn)行術(shù)后更長時間的認(rèn)知功能的評估，這可在今后的研究中進(jìn)一步探討。