大黃素抑制胰腺癌裸鼠原位移植瘤新生血管形成的機(jī)制研究

陳敏遠(yuǎn) 徐錦波 王兆洪 胡萬樂

近30年大量研究證實(shí)，血管生成是許多腫瘤包括胰腺癌發(fā)生的早期事件，也是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的必要條件。微血管密度（MVD）作為檢測腫瘤新生血管形成的金標(biāo)準(zhǔn)由來已久，其是由CD31或CD34等內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物染色后顯微鏡下觀察、計算所得，與腫瘤的侵襲性密切相關(guān)[1]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）作為血管新生重要的促血管生成因子，與腫瘤新生血管形成密切相關(guān)[1]。血管生成素（angiopoietin，Ang）系統(tǒng)及其相關(guān)的因子是繼VEGF之后，人們發(fā)現(xiàn)的又一重要的內(nèi)皮特異性的促血管生成因子。與VEGF不同，Ang系統(tǒng)作用于血管生成的晚期階段，誘導(dǎo)和維持內(nèi)皮細(xì)胞遷移存活，在機(jī)體和腫瘤血管生成中發(fā)揮著重要的作用。Ang家族由Ang-1、Ang-2、Ang-3 和 Ang-4 組成，其中 Ang-1、Ang-2與它們共同的受體酪氨酸激酶受體2（Tie-2）與血管生成密切相關(guān)[2]。胰腺癌是典型的富血管性的腫瘤，其生長和轉(zhuǎn)移都依賴血管生成調(diào)節(jié)因子的調(diào)控。血管生成不僅為腫瘤細(xì)胞的生長提供了營養(yǎng)，更為腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移提供了通路。本研究旨在探討大黃素對胰腺癌裸鼠原位移植瘤新生血管形成相關(guān)因子VEGF、Ang-1、Ang-2及Tie-2表達(dá)的影響及其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要藥物和試劑 大黃素（純度＞98%，美國Sigma公司），用二甲基亞砜（DMSO）溶解（DMSO的終濃度小于 0.1%）；FBS、含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶、RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；Trizol（美國Invitrogen公司）；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（加拿大Fermentas公司）；Ang-1、Ang-2和VEGF抗體（美國Santa Cruz公司）；Tie-2抗體（美國 Abcam公司）；RT-qPCR反應(yīng)所需引物由上海基康生物有限公司合成。

1.2 細(xì)胞株和動物 人胰腺癌細(xì)胞株SW1990購自美國組織培養(yǎng)庫。雌性BALB/c-nu/nu品系的裸小鼠40只，4～6周齡，體重18～20g，均購自中國科學(xué)院上海動物實(shí)驗(yàn)中心。飼養(yǎng)于SPF級屏障系統(tǒng)的潔凈層流架內(nèi)，室溫控制在（25±1）℃，相對濕度40%～60%。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌細(xì)胞株SW1990培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中,置于含5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞單層貼壁穩(wěn)定生長并鋪滿整個培養(yǎng)瓶時用胰蛋白酶消化傳代、分瓶培養(yǎng)，待建立動物模型。

1.4 動物模型制備

1.4.1 皮下移植瘤制備 取對數(shù)生長期的SW1990細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)為2×106）進(jìn)行裸鼠皮下注射，待生長成1cm3皮下移植瘤后取出，無菌條件下去除中央壞死組織，選取周圍健康腫瘤組織剪成1mm3的組織塊待用。

1.4.2 胰腺癌裸鼠原位移植瘤模型制備 戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔麻醉裸鼠，左上腹直肌旁切口，暴露脾臟和胰尾，剪開胰腺被膜，將瘤塊植入胰尾，縫合胰尾被膜。共制備40只裸鼠原位移植瘤模型。

1.5 分組與給藥方法 手術(shù)后第3周開始給藥，將實(shí)驗(yàn)動物采用隨機(jī)數(shù)字表法分為N組（腹腔注射，DMSO終濃度＜0.1%的氯化鈉注射液）、E20組（腹腔注射，20mg/kg大黃素）、E40組（腹腔注射，40mg/kg大黃素）、E80組（腹腔注射，80mg/kg大黃素）4組，每組10只，每周均治療3次，共治療2周[3]。

1.6 胰腺腫瘤重量測定及抑瘤率計算 末次用藥后1周頸椎脫臼法處死4組裸鼠，留取原位移植瘤并稱重，計算抑瘤率，抑瘤率＝（1-給藥組平均瘤質(zhì)量/對照組平均瘤質(zhì)量）×100%。

1.7 原位移植瘤微血管密度（MVD）測定 采用免疫組化法。取固定好的腫瘤組織，經(jīng)脫蠟、水化、3%H2O2封閉以及高壓熱抗原修復(fù)后，加入兔血清封閉，一抗體4℃孵育過夜，PBS洗滌后滴加辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗室溫孵育30min，DAB顯色3～5 min，蘇木素復(fù)染后樹脂封片鏡檢。低倍鏡（×100）下尋取血管熱點(diǎn)區(qū)域，然后高倍鏡（×400）下隨機(jī)選擇5個視野，計數(shù)每個視野中CD31陽性細(xì)胞數(shù)，其平均值即為MVD[4]。

1.8 原位移植瘤Ang-1、Ang-2、Tie-2及VEGF mRNA表達(dá)水平測定 采用RT-qPCR法。按照Trizol試劑盒使用說明書從腫瘤組織提取總RNA，并計算RNA純度和濃度。選取OD260/OD280比值在1.8～2.0的RNA進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。根據(jù)說明書配置好反應(yīng)液，加入隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用羅氏染料進(jìn)行熒光定量，β-actin為內(nèi)參。由LightCycler Real Time PCR擴(kuò)增儀獲取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。RT-qPCR引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.9 原位移植瘤中VEGF、Ang-1、Ang-2及Tie-2蛋白表達(dá)水平測定 采用Western blot法。取新鮮腫瘤組織，RIPA裂解液裂解組織，提取上清液，采用BCA方法測量定量蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品（50μg/孔），8%SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳電泳，濕轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜，用含5%無脂牛奶TBST封閉，滴加一抗4℃孵育過夜，HRP標(biāo)記的二抗孵育2h，用ECL發(fā)光液顯色。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參。采用Totallab 2.1軟件分析Western印跡圖像。以目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶吸光度值的比值反映VEGF、Ang-1、Ang-2及Tie-2蛋白的相對表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組裸鼠原位移植瘤重量和抑瘤率的比較 E40組、E80組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表 2。

表2 4組裸鼠原位移植瘤重量和抑瘤率的比較

2.2 4組裸鼠原位移植瘤組織MVD的比較 4組裸鼠的MVD表達(dá)見圖1。其中N組MVD為19.3±1.9，E20組 MVD 為 11.7±1.6，E40 組 MVD 為 7.9±2.3，E80 組MVD為7.2±1.8。各試驗(yàn)組MVD與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。

圖1 4組裸鼠原位移植瘤組織MVD的表達(dá)（a：N組；b：E20組；c：E40 組；d：E80 組；箭頭提示血管熱點(diǎn)區(qū)域；DBA 顯色，×400）

2.3 4組裸鼠原位移植瘤組織中VEGF、Ang-1、Ang-2及Tie-2 mRNA表達(dá)水平的比較 E20組、E40組、E80組的VEGF、Ang-1、Ang-2及Tie-2 mRNA表達(dá)與N組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2。

2.4 4組裸鼠原位移植瘤組織中VEGF、Ang-1、Ang-2及Tie-2蛋白表達(dá)水平的比較 E20組、E40組及E80組的VEGF、Ang-1、Ang-2及Tie-2蛋白與N組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖3。

圖2 4組裸鼠原位移植瘤組織中VEGF、Ang-1、Ang-2及Tie-2 mRNA表達(dá)水平的比較（與對照組比較，*P＜0.05）

圖3 4組裸鼠原位移植瘤組織中VEGF、Ang-1、Ang-2及Tie-2蛋白表達(dá)水平的比較（a：4組 VEGF、Ang-1、Ang-2及 Tie-2蛋白表達(dá)水平的比較；b：4組 VEGF、Ang-1、Ang-2及 Tie-2蛋白表達(dá)的電泳圖；與對照組比較，*P＜0.05）

3 討論

大量實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，腫瘤的生長依賴于血管新生[4]。隨著腫瘤MVD的增加，其侵襲周圍組織以及轉(zhuǎn)移至其他臟器的能力明顯增強(qiáng)。MVD被認(rèn)為是預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后的一項重要指標(biāo)[5]。本研究通過對移植瘤組織中CD31的檢測，從而確定其MVD。在本研究中，大黃素各劑量組的MVD均＜N組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。這一結(jié)果與之前的文獻(xiàn)報道相一致[3]，因此筆者推斷，大黃素可通過抑制腫瘤血管新生而抑制腫瘤的生長、發(fā)展。

VEGF作為血管新生重要的促血管生成因子，與腫瘤新生血管形成密切相關(guān)。本研究中課題組通過對胰腺癌裸鼠原位移植瘤組織中VEGF蛋白和mRNA的分析得到，VEGF在N組中蛋白以及mRNA均高表達(dá)，而在大黃素各劑量組中均低表達(dá)，且與大黃素濃度呈負(fù)相關(guān)。大黃素可能通過抑制VEGF的表達(dá)，使VEGF與其受體的結(jié)合減少[1]，從而降低其促血管生成的作用。

在血管形成的早期，VEGF可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，形成初級血管網(wǎng)，但是VEGF單純過表達(dá)誘導(dǎo)的新生血管是不成熟的，血管的成熟有賴于Ang/Tie通路的作用。生理狀態(tài)下，Ang-1和VEGF的作用相輔相成，在產(chǎn)生新生血管的過程中發(fā)揮著各自的功能。Ang-1與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面Tie-2受體結(jié)合，促進(jìn)其磷酸化啟動這一信號通路，進(jìn)而使血管周圍細(xì)胞圍繞內(nèi)皮細(xì)胞，形成支架結(jié)構(gòu)，使血管壁連續(xù)而完整，完成血管再構(gòu)這一過程。所以Ang-1能維持血管的完整，對血管形成必不可少[6]。Ang-1在乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肝癌、膽管細(xì)胞癌以及胰腺癌等多種腫瘤中扮演著不同的角色[7-9]。Ang-2是Ang-1的天然拮抗劑，通過與Ang-1競爭同一受體阻斷Ang-1的作用[6]。Ang-2與Tie-2受體結(jié)合后，可阻斷其磷酸化。Ang-2可抑制血管周圍細(xì)胞的聚集，使其不再圍繞內(nèi)皮細(xì)胞形成支撐，也能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，減少周細(xì)胞覆蓋，導(dǎo)致血管處于一種不穩(wěn)定狀態(tài)，從而促進(jìn)血管新生的發(fā)生。Ang-2的促血管生成作用與局部微環(huán)境以及VEGF等生長因子密切相關(guān)[6,10]。當(dāng)存在VEGF時，其可與VEGF協(xié)同刺激血管的出芽生長，形成新生血管[11]；而在沒有VEGF等生長因子存在的條件下，其可阻斷Ang-1穩(wěn)定血管的作用，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，顯微鏡下可見血管退化，微血管密度降低[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可抑制Ang-1的表達(dá)，且大黃素各劑量組與N組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。合理的解釋是，Ang-1表達(dá)減少使得Ang-1與VEGF協(xié)同形成新生血管的能力降低，減少了腫瘤組織微血管的形成。本研究還發(fā)現(xiàn)，大黃素可抑制Ang-2、Tie-2的表達(dá)，且大黃素各劑量組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。這表明大黃素可能一方面通過對VEGF表達(dá)的影響，從而影響Ang-2、Tie-2的表達(dá)以及作用，另一方直接作用于Ang-2、Tie-2，從而抑制其表達(dá)，達(dá)到抑制胰腺癌血管新生的作用。

本研究表明大黃素可抑制胰腺癌裸鼠原位移植瘤的血管新生，大黃素對血管新抑制方式可能是以通過抑制 VEGF、Ang-1、Ang-2、Tie-2 為主。該研究結(jié)果將為大黃素用于臨床胰腺癌治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但還需進(jìn)一步的動物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)加以驗(yàn)證。