金雀異黃酮酊對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠OPG/RANKL/RANK通路的影響

陳洪燕，汪何畏，熊 軍，李亞玲*

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院信息部，瀘州 646000)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨強(qiáng)度受損導(dǎo)致骨折危險(xiǎn)性升高為特征的全身代謝性骨骼疾病，好發(fā)于絕經(jīng)后的婦女[1-2]。人體內(nèi)的骨重建是由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞所調(diào)控的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，當(dāng)破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨再吸收比成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成更多時(shí)將導(dǎo)致這種病理性骨疾病[3]。研究發(fā)現(xiàn)，許多細(xì)胞因子、激素等均可直接或間接地調(diào)節(jié)骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)和破骨細(xì)胞分化因子(kappa-B ligand，RANKL)及核因子-κB 受體活化因子(receptor activator of NF-κB，RANK)之間的關(guān)系，參與骨重建過(guò)程，因而OPG/RANKL/RANK信號(hào)系統(tǒng)已成為防治骨質(zhì)疏松的新靶點(diǎn)[4]。金雀異黃酮(genistein，Gen)作為一種具有雌激素活性而沒(méi)有雌激素不良反應(yīng)的替代物受到人們的重視[5]，本研究擬探討金雀異黃酮防治OP的機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1儀器 Delphi A雙能X線骨礦含量測(cè)定儀(美國(guó)Hologic公司)；AU-2700全自動(dòng)生化分析儀(日本Olympus公司)；PIK-1200酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；TS-200轉(zhuǎn)移脫色搖床(海門市其林貝爾儀器廠)；165-8001垂直電泳槽,Gel Doc XR+凝膠掃描成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；BP211D分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；TGL-16G臺(tái)式冷凍離心機(jī)(北京醫(yī)療儀器廠)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3月齡健康雌性SD大鼠，體質(zhì)量為200～250 g，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(川2013-17)，購(gòu)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2 方法

2.2動(dòng)物分組 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將30只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和金雀異黃酮酊組，每組10只。將各組大鼠以100 g·L-1水合氯醛腹腔麻醉，假手術(shù)組行假性手術(shù)摘除卵巢周圍1 g的脂肪組織，模型組和金雀異黃酮酊組均切除雙側(cè)卵巢。術(shù)后采用標(biāo)準(zhǔn)飲食(不含豆類)恢復(fù)性飼養(yǎng)8周后，假手術(shù)組和模型組每日給予蒸餾水噴涂雙側(cè)股骨段皮膚，金雀異黃酮酊組給予金雀異黃酮酊10 mg·kg-1·d-1噴涂雙側(cè)股骨段皮膚，連續(xù)用藥8周。所有大鼠均在同等條件下喂養(yǎng)，自由攝水，控制食量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后頸椎脫臼處死大鼠，腹主動(dòng)脈取血，同時(shí)摘取各組大鼠子宮，觀察并稱定質(zhì)量。

2.3骨密度測(cè)定 干預(yù)治療8周后，采用Delphi A雙能X線骨礦含量測(cè)定儀測(cè)定雙側(cè)股骨干骺端骨密度值(bone mineral density，BMD)。

2.4血清鈣和磷測(cè)定 干預(yù)治療8周后，采用AU-2700全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中鈣(Ca)和磷(P)的含量。

2.5Elisa法測(cè)定血清雌激素、堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OC)和Ⅰ型膠原交聯(lián)c-末端肽(S-CTX)含量 干預(yù)治療8周后，按照Elisa試劑盒使用說(shuō)明書，依次將樣品血清稀釋、加樣，加酶標(biāo)抗體，加顯色劑、終止液，用酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度值A(chǔ)，并按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。

2.6Western Blot法測(cè)定血清OPG和RANKL蛋白表達(dá)水平 干預(yù)治療8周后，依次提取血清總蛋白，進(jìn)行二喹啉甲酸(BCA)法蛋白濃度測(cè)定，蛋白樣品上樣電泳，蛋白轉(zhuǎn)膜，封閉，并分別用OPG和RANKL抗體進(jìn)行一抗雜交，然后與HRP標(biāo)記的二抗孵育，經(jīng)電化學(xué)(ECL)發(fā)光檢測(cè)、顯影定影后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1各組大鼠體質(zhì)量、子宮質(zhì)量和血清雌激素水平的變化情況 各組大鼠初始體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，去卵巢造模8周后(干預(yù)前)，各組大鼠體質(zhì)量均增加，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在施加干預(yù)8周后(干預(yù)后)，各組大鼠體質(zhì)量均增加，但與模型組比較，假手術(shù)組和金雀異黃酮酊組體質(zhì)量增加均較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與假手術(shù)組比較，模型組和金雀異黃酮酊組大鼠子宮明顯萎縮、質(zhì)量明顯降低，模型組血清雌激素水平亦明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示卵巢去勢(shì)成功，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2各組大鼠股骨干骺端骨密度變化情況 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨密度顯著降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，金雀異黃酮酊組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，金雀異黃酮酊組大鼠骨密度明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠股骨干骺端骨密度變化情況

注：與假手術(shù)組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05。

Fig.1 Changes of femur BMD in each group

Note:*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs OVX group.

表1 各組大鼠體質(zhì)量、子宮質(zhì)量和血清雌激素水平變化情況

組別初始體質(zhì)量/g干預(yù)前體質(zhì)量/g干預(yù)后體質(zhì)量/g子宮質(zhì)量/g雌激素水平/ng·mL-1假手術(shù)組204.41±5.21245.25±6.23280.51±10.62#0.701±0.01582.23±10.31模型組207.64±7.53249.12±7.35313.23±13.510.351±0.016?52.78±8.77?金雀異黃酮酊組201.98±4.67243.42±7.54287.01±11.21#0.587±0.013?77.96±7.45

注：與假手術(shù)組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05。

3.3各組大鼠骨代謝、骨轉(zhuǎn)換生物標(biāo)志物變化情況 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的骨代謝標(biāo)志物Ca和P的含量均明顯降低，而骨形成標(biāo)志物(ALP和OC)、骨吸收標(biāo)志物(S-CTX)含量均明顯增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示絕經(jīng)后大鼠體內(nèi)骨轉(zhuǎn)換率急劇增加，而金雀異黃酮酊組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，金雀異黃酮酊組大鼠骨代謝標(biāo)志物Ca和P的含量均明顯增加、骨形成標(biāo)志物(ALP和OC)和骨吸收標(biāo)志物(S-CTX)含量明顯降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠骨代謝、骨轉(zhuǎn)換生物標(biāo)志物變化情況

組別Ca含量/mmol·L-1P含量/mmol·L-1ALP水平/U·L-1OC水平/ng·mL-1S-CTX含量/ng·mL-1假手術(shù)組2.31±0.14#2.02±0.11#121.12±12.43#11.81±3.01#19.33±4.45#模型組1.79±0.13?1.43±0.22?200.07±17.45?18.57±4.11?29.07±4.88?金雀異黃酮酊組2.25±0.16#1.87±0.21#135.36±15.89#13.27±2.67#23.01±3.53#

注：與假手術(shù)組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05。

3.4各組大鼠OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路變化情況 各組大鼠經(jīng)不同干預(yù)后，采用Western Blot法檢測(cè)血清OPG和RANKL蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠OPG蛋白表達(dá)水平明顯下降，RANKL蛋白表達(dá)水平明顯增加，導(dǎo)致OPG/RANKL比率明顯降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，金雀異黃酮酊組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，金雀異黃酮酊組大鼠OPG蛋白表達(dá)水平明顯增加，RANKL蛋白表達(dá)水平明顯下降，導(dǎo)致OPG/RANKL比率明顯提高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠OPG/RANKL信號(hào)通路變化情況

A.各組大鼠OPG和RANKL蛋白表達(dá)情況；B.各組大鼠OPG蛋白相對(duì)表達(dá)量；C.各組大鼠RANKL蛋白相對(duì)表達(dá)量；與假手術(shù)組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05。

Fig.2 Changes of OPG/RANKL signal pathway in each group

A.the OPG and RANKL protein expression in each group; B.the relative expression of OPG protein in each group; C.the relative expression of RANKL protein in each group；*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs OVX group.

4 討論

近年來(lái)，雌激素療法因其潛在的并發(fā)癥如乳腺癌、出血和心血管事件使其在防治OP中的應(yīng)用受到限制，而防治OP的天然藥物，如金雀異黃酮酊、蛇床子素[6]和石斛堿[7]等取得很大的進(jìn)展，因此，本研究通過(guò)制備金雀異黃酮酊，模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥體外模型，進(jìn)一步研究金雀異黃酮酊對(duì)OP的防治效果。

去卵巢大鼠是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥使用最廣泛的動(dòng)物模型。去卵巢大鼠的骨骼生理特征與中老年早期絕經(jīng)后的婦女相似，包括骨轉(zhuǎn)換的增加和松質(zhì)骨比正常骨的損失更大[8]。本研究通過(guò)切除大鼠雙側(cè)卵巢從而引起雌激素的減少，模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型，研究發(fā)現(xiàn)，卵巢切除的大鼠子宮明顯萎縮，質(zhì)量變輕，提示模型大鼠去勢(shì)成功；由于卵巢功能的衰退，雌激素的分泌量明顯減少，脂代謝異常，食欲亢進(jìn)導(dǎo)致進(jìn)食較多引起肥胖[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組造模16周后大鼠雌激素明顯降低，體質(zhì)量明顯增加，而通過(guò)外用金雀異黃酮酊干預(yù)后，可明顯抑制去卵巢大鼠的體質(zhì)量增加和雌激素的下降，可能與金雀異黃酮酊的類雌激素藥理作用能調(diào)動(dòng)體內(nèi)脂肪轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)脂肪組織凋亡有關(guān)[10]。

骨密度測(cè)量是明確骨質(zhì)疏松診斷及療效評(píng)價(jià)的主要手段[11]，研究發(fā)現(xiàn)，去卵巢大鼠的骨密度明顯降低，表明切除卵巢誘導(dǎo)骨質(zhì)流失；而骨代謝與骨轉(zhuǎn)換相關(guān)的生物標(biāo)志物的變化進(jìn)一步證明去卵巢大鼠與中老年早期絕經(jīng)后婦女骨變化生理機(jī)能相似。通過(guò)外用金雀異黃酮酊干預(yù)后，能明顯增加去卵巢大鼠的骨密度，改善絕經(jīng)后大鼠的骨質(zhì)流失，具有防治骨質(zhì)疏松的效果。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者骨轉(zhuǎn)換加速導(dǎo)致骨代謝生化標(biāo)志物變化，這種變化不僅可以反映骨吸收與骨形成的平衡狀況，而且在骨質(zhì)疏松癥早期診斷、臨床療效評(píng)價(jià)和指導(dǎo)臨床用藥方面具有重要價(jià)值。血清中Ca和P是反映骨吸收最直接的指標(biāo)，能夠發(fā)現(xiàn)明顯的骨吸收，但敏感度低，與骨質(zhì)疏松的相關(guān)性存在爭(zhēng)議[12]。結(jié)果表明，外用金雀異黃酮酊能明顯增加血清中Ca和P的水平，可能與金雀異黃酮酊改善胃腸道Ca和P的吸收有關(guān)。

血清骨堿性磷酸酶(ALP)是成骨細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，是骨形成的常用指標(biāo)[13]，有促進(jìn)骨基質(zhì)磷沉積、加強(qiáng)礦化作用，更年期骨質(zhì)疏松癥婦女ALP顯著升高[14]；本研究中，金雀異黃酮酊組ALP活性明顯低于模型組，說(shuō)明金雀異黃酮酊對(duì)ALP活性具有一定的抑制作用。骨鈣素(OC)主要存在于骨和牙本質(zhì)中，主要由成骨細(xì)胞分泌并累積在骨骼的細(xì)胞外基質(zhì)中[15]。血清OC水平從30歲開(kāi)始增加，特別是絕經(jīng)后顯著高于絕經(jīng)前，骨轉(zhuǎn)換率急劇增加[16]。研究表明，接受6個(gè)月以上雌激素治療的婦女血清OC的濃度可降低至絕經(jīng)前的水平[17]。本研究結(jié)果顯示，外用金雀異黃酮酊治療8周后，去卵巢大鼠血清OC濃度可恢復(fù)至假手術(shù)組水平。血清S-CTX由破骨細(xì)胞分解Ⅰ型膠原后形成，是目前國(guó)際公認(rèn)的代表骨吸收的生化指標(biāo)[18]，女性絕經(jīng)后S-CTX含量隨年齡增長(zhǎng)而升高，尤其是絕經(jīng)后高轉(zhuǎn)換型OP患者和骨折患者明顯高于絕經(jīng)前，本研究結(jié)果顯示，外用金雀異黃酮酊治療8周后，去卵巢大鼠血清S-CTX濃度明顯下降。通過(guò)上述分析發(fā)現(xiàn)，金雀異黃酮酊能通過(guò)降低骨形成和骨吸收生物標(biāo)志物，改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠的高骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)，從而治療絕經(jīng)后OP，減少骨折風(fēng)險(xiǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)，金雀異黃酮酊可通過(guò)激活MAPK/NF-κB/AP-1誘導(dǎo)ERα基因表達(dá)，并因此刺激分化相關(guān)的基因表達(dá)和成骨細(xì)胞礦化[19]，隨著分子生物學(xué)在OP領(lǐng)域的深化，與TNF受體有關(guān)的蛋白質(zhì)RANKL和OPG成為介導(dǎo)骨質(zhì)疏松骨轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵因素。RANKL與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞或破骨細(xì)胞表面上的RANK結(jié)合，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和激活，并抑制其凋亡；而OPG阻止RANKL與RANK的結(jié)合，起負(fù)調(diào)節(jié)作用，延緩前體破骨細(xì)胞的分化，降低骨吸收[20]。因此，RANKL和OPG比率的動(dòng)態(tài)平衡在骨吸收中起重要的控制作用。本研究結(jié)果表明，與模型組比較，金雀異黃酮酊組OPG水平較高，RANKL水平較低，導(dǎo)致OPG與RANKL比率提高，提示外用金雀異黃酮酊對(duì)去卵巢大鼠OPG水平有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，而對(duì)RANKL水平有較強(qiáng)的抑制作用，從而抑制破骨細(xì)胞的形成和骨重吸收，緩解絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松的骨質(zhì)高轉(zhuǎn)換狀態(tài)。

綜上所述，外用金雀異黃酮酊可顯著調(diào)節(jié)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨代謝，提高去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度，使骨質(zhì)疏松大鼠OPG蛋白表達(dá)提高，RANKL蛋白表達(dá)下降。但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步從上下游信號(hào)通路進(jìn)行研究，為未來(lái)臨床治療絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松提供新的選擇。