HPLC法同時測定不同產(chǎn)地甘西鼠尾草及丹參中8種主要成分的含量

王亞峰，王生彪，朵德龍，王愛霞，崗桑卓瑪，嚴英俊

(青海省人民醫(yī)院，西寧 810007)

甘西鼠尾草(SalviaprzewalskiiMaxim)為唇形科鼠尾草屬弧隔鼠尾草亞屬毛地黃鼠尾草，是優(yōu)良的傳統(tǒng)中草藥，其主要有效成分與丹參類似，包括水溶性的酚酸類成分和脂溶性的丹參酮類成分[1-2]，作為其代用品在臨床上發(fā)揮重要作用[3-5]。研究表明，甘西鼠尾草具有保護心肌缺血細胞和心肌缺血再灌注損傷細胞、改善血液流變學、保護神經(jīng)細胞、利尿、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗血栓、抗抑郁和抑制黃嘌呤氧化酶等作用[6-16]，還可抑制乳腺癌、肺癌、肝癌、白血病和胃癌等多種腫瘤細胞株的生長[17-19]以及結(jié)腸癌細胞的侵襲和遷移[20]。此外，有報道稱甘西鼠尾草還具有抗缺氧作用，因此甘西鼠尾草在治療心血管疾病、抗癌、抗炎和高原病方面具有廣闊的應用前景。

甘西鼠尾草還未收載入《中國藥典》，只收載于《甘肅省中藥材質(zhì)量標準》和《云南省藥品標準》等地方標準中[5]。青海甘西鼠尾草主產(chǎn)于尖扎、同仁以及民和等縣區(qū)，生于海拔1 900～3 800 m的山谷、林下、山坡和河灘[21]。質(zhì)量標準無章可循，因此急需在這方面進行研究。本文建立了可同時測定甘西鼠尾草中8種化學成分的HPLC法，通過比較不同產(chǎn)地甘西鼠尾草與丹參中8種成分的含量，為建立和完善青海甘西鼠尾草的質(zhì)量標準，挖掘青海甘西鼠尾草藥材以及進一步研究其抗缺氧活性提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters 600分析型高效液相色譜儀(包括Waters 2998 PAD檢測器、Waters 2707自動進樣器和Empower色譜工作站)，色譜柱SunFire C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)(美國Waters公司)；XP205型分析天平(美國梅特勒-托利多公司)；KJ-11030AL型超聲波清洗儀(深圳市科潔超聲科技有限公司)。

1.2試藥 乙腈、甲醇為色譜純(德國Merck公司)；丹參酮ⅡA對照品(批號 110766-201721)、隱丹參酮對照品(批號110852-200806)、丹參酮Ⅰ對照品(批號110867-201607)、丹酚酸B對照品(批號111562-201716)、迷迭香酸對照品(批號111871-201706)和丹參素鈉對照品(批號110855-201614)，均購自中國食品藥品檢定研究院；紫草酸對照品(批號CAS 28831-65-4)和二氫丹參酮Ⅰ對照品(批號CAS 87205-99-0)，均購自北京萊耀生物科技有限公司(質(zhì)量分數(shù)≥98%)。甘西鼠尾草樣品均采自10月份花期后，丹參樣品均購自成都睿智中藥材有限責任公司，所有樣品經(jīng)青海師范大學生命科學學院院長、博士生導師陳志教授鑒定為唇形科植物甘西鼠尾草及丹參。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1混合對照品溶液 精密稱取丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA對照品，置于同一量瓶中，加體積分數(shù)為80%的甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為218.27，137.10，264.50,164.20，138.50，157.40，296.00和150.50 μg·mL-1的混合對照品溶液，置于2～8 ℃冰箱中用錫箔紙避光保存。

2.1.2供試品溶液 取不同產(chǎn)地采集的甘西鼠尾草根，在陰涼處晾干、粉碎，過3號篩，精密稱取過篩后的粉末1.0 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL體積分數(shù)為80%的甲醇，超聲(功率180 W，頻率40 kHz)提取50 min，以3 000 r·min-1離心30 min，過濾。過濾后以同樣方法用50 mL甲醇提取2次。合并濾液作為供試品溶液，置于2～8 ℃冰箱中用錫箔紙避光保存。

2.2方法學考察

2.2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱：SunFire C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動相：乙腈(A)-0.8 mL·L-1的甲酸超純水溶液(B)，梯度洗脫(0～19 min，20%A～60%A；19～49 min，60%A～81%A；49～53 min，81%A～91%A；53～57 min，95%A)，流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：270 nm；柱溫：26 ℃；進樣量：2 μL。在上述色譜條件下，理論塔板數(shù)均大于4 000，樣品中8個被測組分的色譜峰與相鄰峰的分離度R>1.5，拖尾因子符合要求，混合對照品及甘西鼠尾草樣品色譜圖見圖1。

圖1 HPLC圖

A.混合對照品溶液；B.供試品溶液；1.丹參素鈉；2.迷迭香酸；3.紫草酸；4.丹酚酸B；5.二氫丹參酮Ⅰ；6.隱丹參酮；7.丹參酮Ⅰ；8.丹參酮ⅡA。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.mixed reference substance;B.sample solution;1.sodium danshensu；2.rosmarinic acid；3.lithospermic acid；4.salvianolic acid B；5.dihydrotanshinquinone-Ⅰ；6.cryptotanshinone；7.tanshinoneⅠ；8.tanshinone ⅡA.

2.2.2線性范圍考察 將2.1.1項下制備的混合對照品溶液，用體積分數(shù)為80%的甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，用高效液相色譜儀進行分析，進樣時用棕色進樣瓶，記錄峰面積。以各對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)，用origin軟件繪制標準曲線，結(jié)果見表1，表明各化合物在相應范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 8個待測化合物的回歸方程和線性范圍

Tab.1 Regression equations and linear ranges of the 8 active compounds analyzed by HPLC

2.2.3精密度實驗 精密吸取2.1.2項下制備的供試品溶液，按照2.2.1項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，測定8種待測組分的峰面積，結(jié)果丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA峰面積的RSD(n=6)值分別為0.7%，0.5%，1.4%，0.9%，1.1%，1.3%，1.7%和0.3%，表明該方法精密度良好。

2.2.4重復性實驗 取同一批樣品6份，按照2.1.2項下方法制得供試品溶液，按照2.2.1項下色譜條件進樣分析，測定8種待測組分的含量，結(jié)果丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA含量的平均值(n=6)為0.103%，3.375%，0.009%，2.399%，0.727%，1.500%，1.033%和2.354%。RSD值分別為0.6%，0.4%，1.5%，1.1%，1.2%，0.7%，1.7%和0.1%，表明該方法重復性良好。

2.2.5加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的甘西鼠尾草粉末6份，每份1.0 g。分別加入2.1.1項下制備的混合對照品溶液，按照2.1.2項下方法制備供試品溶液，進樣分析，記錄峰面積，計算丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的平均回收率分別為98.8%，101.8%，98.8%，97.9%，99.8%，101.3%，100.2%和100.2%，RSD值分別為2.1%,1.1%,1.4%,1.7%,0.5%,2.3%,1.6%和0.2%,表明該方法回收率良好。

2.3樣品的測定 取不同產(chǎn)地的丹參及甘西鼠尾草，按照2.1.2項下方法制備供試品溶液，按照2.2.1項下色譜條件進行分析，通過峰面積，用外標法計算丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的含量，進行對比。測定結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果

Tab.2 Results of the content determination of samples (n=3)

編號產(chǎn)地含量/%丹參素鈉迷迭香酸紫草酸丹酚酸B二氫丹參酮Ⅰ隱丹參酮丹參酮Ⅰ丹參酮ⅡA1青海黃南種植0.3736.7500.3712.6420.6110.7920.7991.1942青海黃南野生0.4224.7310.3301.0630.3220.6390.3411.4283青海民和前河0.1093.9370.4192.4100.7251.5191.0922.5984青海民和西溝0.1462.8400.2350.7710.3510.5980.1911.0135云南迪慶0.0761.3790.1790.0610.0480.2320.0070.5846隴南野生0.1911.4830.1941.1440.2860.4260.3770.8577西藏朗縣0.1593.9580.1950.4790.0900.2520.5961.2008西藏加查0.3552.6420.4990.4460.0860.2140.4601.1409隴南丹參0.5630.253—8.7910.1210.2230.1350.30010陜西丹參0.7820.6060.63617.7700.1060.4000.0090.62411山東丹參0.2410.1760.4714.7930.3960.6080.4600.847

注：—表示未檢測到。

3 討論

以8種化合物的含量作為考察指標，采用單因素法，參考程沛等[21]及胡偉慧等[22]研究報道，考察了在提取溶劑為50 mL的超聲提取下，提取溶劑為體積分數(shù)為50%，60%，70%，80%及90%的甲醇，提取次數(shù)為1，2和3次，提取時間為25，35，45，55和60 min對提取效率的影響，最終確定甘西鼠尾草樣品的提取方法為50倍體積分數(shù)為80%的甲醇超聲提取2次，每次45 min，此條件提取率高，干擾雜質(zhì)少。

由表2測定結(jié)果可知，不同產(chǎn)地甘西鼠尾草同一樣品中，水溶性成分主要為迷迭香酸，其次為丹酚酸B，丹參素鈉和紫草酸含量較少，脂溶性成分主要為丹參酮ⅡA，其次為隱丹參酮。對比可知，1號(青海黃南種植)樣品的水溶性成分最高，迷迭香酸含量達到了6.750%，除丹參酮ⅡA和丹參素鈉外，1號樣品中其他6種成分均高于2號(青海黃南野生)樣品。3號(青海民和前河)樣品中4種脂溶性成分含量最高，二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA含量分別為0.725%，1.519%，1.092%和2.598%。4號(青海民和西溝)樣品采自溫度較低、光照較弱的河邊樹林地區(qū)，6種成分含量均小于1，2和3號，故甘西鼠尾草中8種成分的含量可能與生長適宜的光照和溫度關(guān)系較大。比較青海地區(qū)甘西鼠尾草與5號(云南迪慶)、6號(隴南野生)、7號(西藏朗縣)和8號(西藏加查)樣品，8號樣品紫草酸含量最高，為0.499%，但低于陜西丹參的0.636%。

比較青海甘西鼠尾草和不同產(chǎn)地丹參的測定結(jié)果可知，青海甘西鼠尾草與丹參(9，10和11號)相比，水溶性成分中,陜西丹參在丹參素鈉和紫草酸含量上均高于其他樣品，丹參樣品中的丹酚酸B含量較高，其中10號(陜西丹參)樣品高達17.770%，為1號樣品的6.5倍，而青海甘西鼠尾草迷迭香酸的含量較丹參樣品高，其中1號樣品中迷迭香酸含量為10號樣品的10倍。除4號樣品外，4種脂溶性成分中隱丹參酮和丹參酮ⅡA的含量青海甘西鼠尾草均高于丹參樣品。3種丹參樣品中陜西丹參的水溶性成分較高，山東丹參的脂溶性成分較高。

不同來源的甘西鼠尾草水溶性和脂溶性成分含量差異顯著，青海不同產(chǎn)地甘西鼠尾草較其他產(chǎn)地甘西鼠尾草脂溶性成分和水溶性成分均有較好的優(yōu)勢。甘西鼠尾草作為丹參的替代品，雖已在臨床廣泛應用，但與丹參相比主要的差別在于丹酚酸B和迷迭香酸的含量，青海不同產(chǎn)地甘西鼠尾草，除丹酚酸B的含量較丹參樣品低，4種脂溶性成分均優(yōu)于丹參樣品。本文建立的HPLC法可同時測定甘西鼠尾草及丹參中的8種成分，保留時間穩(wěn)定，分離度高，測定結(jié)果準確，方法精密度高，所得結(jié)果能為建立和完善青海甘西鼠尾草的質(zhì)量標準、挖掘青海甘西鼠尾草藥材及進一步研究其抗缺氧活性提供依據(jù)。

致謝：感謝青海師范大學生命科學學院陳志院長的悉心教導，感謝碩士研究生宋道光和熊元治對本實驗的幫助和支持。