不同類型豬舍內(nèi)氣溶膠中致病菌數(shù)量和內(nèi)毒素水平的比較研究

許銘洙，張 勇，郭振東，嚴(yán)鴻林，*，張宏福，劉靜波，

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春 130122；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

當(dāng)前我國(guó)集約化規(guī)模化的養(yǎng)豬生產(chǎn)模式養(yǎng)殖密度大、豬舍全封閉且豬舍空間相對(duì)有限。這種全封閉且高密度的養(yǎng)殖模式相對(duì)于傳統(tǒng)的開放式和低密度養(yǎng)殖模式，豬舍中氣溶膠的濃度顯著增加，進(jìn)而加劇對(duì)飼養(yǎng)人員和舍內(nèi)動(dòng)物呼吸道的刺激，增加了養(yǎng)豬生產(chǎn)從業(yè)人員和豬只本身患呼吸道疾病的風(fēng)險(xiǎn)。陳冠希等[1]用豬舍氣溶膠處理小鼠導(dǎo)致了其肺臟的組織病理變化并提高了肺臟中炎性因子的表達(dá)。豬舍氣溶膠中的致病微生物和內(nèi)毒素可能是引起上述問題的主要原因[2]。前人研究表明，全封閉式豬舍氣溶膠中含有大量的致病菌和內(nèi)毒素，其中主要致病菌為彎曲桿菌（Campylobacter）、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌（C.perfringens）、腸球菌（Enterococcus）和大腸埃希菌（E.coli），且致病菌和內(nèi)毒素的水平受諸多環(huán)境因素的影響[3]?？諝庵械膬?nèi)毒素含量與需氧菌豐度存在一定的相關(guān)關(guān)系，特別是與其中需氧的革蘭氏陰性菌的水平存在正相關(guān)關(guān)系[4]。豬舍氣溶膠中微生物主要來(lái)源于豬糞便，分子生物學(xué)和高通量測(cè)序手段均揭示豬糞便微生物組成與豬舍氣溶膠微生物組成存在極大的相似性[5-6]。前人研究也發(fā)現(xiàn)，影響豬糞便微生物的處理手段同樣也能改變豬舍氣溶膠微生物的組成[7]。豬的糞便微生物組成受諸多因素的影響，其中不同生產(chǎn)階段的豬糞便微生物組成存在顯著差異[8]。P.Y.Hong 等[7]研究表明，不同的生產(chǎn)階段可影響豬舍氣溶膠的微生物組成，再次證明豬糞便微生物組成和豬舍氣溶膠微生物組成的關(guān)聯(lián)性。但是不同的生產(chǎn)階段對(duì)豬舍氣溶膠中致病微生物數(shù)量和內(nèi)毒素含量是否也有著顯著的影響，目前尚不可知。

在現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)中，不同生產(chǎn)階段的豬獨(dú)立飼養(yǎng)于不同類型的豬舍中，主要分為保育舍、生長(zhǎng)育肥舍、妊娠舍和分娩舍。這4 種類型的豬舍與所圈養(yǎng)的豬只生產(chǎn)階段相對(duì)應(yīng)，且養(yǎng)殖密度和豬舍環(huán)境參數(shù)如溫濕度明顯不同。除上文所述豬只糞便微生物在很大程度上決定了豬舍氣溶膠微生物的組成外，豬舍環(huán)境參數(shù)同樣也對(duì)豬舍氣溶膠微生物組成有著極大的影響[6]。鑒于不同類型豬舍中豬只微生物組成以及環(huán)境參數(shù)的差異，我們推測(cè)不同的豬舍類型對(duì)氣溶膠中致病微生物和內(nèi)毒素有著顯著的影響。

本研究通過比較不同類型豬舍內(nèi)氣溶膠中Campylobacter、C.perfringens、Enterococcus 和E.coli的數(shù)量及內(nèi)毒素的含量，旨在考察豬舍類型對(duì)氣溶膠中致病微生物數(shù)量和內(nèi)毒素含量的影響，為進(jìn)一步探明豬舍氣溶膠的致病機(jī)理提供參考和積累資料。

1 材料和方法

1.1 試劑、材料與儀器

無(wú)熱源質(zhì)生理鹽水（湛江安度斯生物有限責(zé)任公司）；

LAL試劑盒（QLC-100BioWhittaker，Walkersvile，MD）；

安德森6 級(jí)撞擊式采樣器（遼寧市醫(yī)療器械廠）；

AGI-30 空氣采樣器（Ace Glass，Inc.，Vineland，NJ，USA）；

電熱恒溫培養(yǎng)箱（DH4000A 型，天津泰斯特儀器有限公司）；

NanoDrop ND-1000（Nanodrop Technologies，Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA）；

ABI7600 熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA）；

酶標(biāo)儀（Tecan，Austria）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇32 棟封閉式豬舍進(jìn)行空氣樣品采集，共4種類型豬舍，分別為保育舍、生長(zhǎng)育肥舍、妊娠舍和分娩舍，每種類型豬舍各8 棟，試驗(yàn)圈舍飼養(yǎng)豬只品種為DLY。保育舍和生長(zhǎng)育肥舍大小均為36 m×9 m×3.5 m，保育舍內(nèi)兩列共24 個(gè)豬欄和一條走廊，飼養(yǎng)約480 頭仔豬，舍內(nèi)溫度27 ℃左右；育肥舍兩列共24 個(gè)豬欄和一條走廊，飼養(yǎng)約200 頭育肥豬，舍內(nèi)溫度20 ℃左右。妊娠舍大小為32 m×8 m×3.5 m，舍內(nèi)設(shè)兩列限位欄和3 條走廊，飼養(yǎng)100 頭妊娠母豬，舍內(nèi)溫度20 ℃左右。分娩舍大小為30 m×8 m×3.5 m，舍內(nèi)設(shè)兩列產(chǎn)床和3 條走廊，飼養(yǎng)30 頭哺乳母豬，舍內(nèi)溫度22 ℃左右。所有豬舍采用隧道式通風(fēng)，安有兩個(gè)換氣風(fēng)扇，通風(fēng)良好，舍內(nèi)均鋪板條式漏糞地板并設(shè)排糞暗溝，豬舍濕度控制在60%左右。于2017年7月20日采用AGI-30 收集器采集空氣樣品用于致病菌豐度和內(nèi)毒素含量的測(cè)定，同時(shí)采用安德森6 級(jí)采樣器采集空氣樣品用于需氧菌含量的測(cè)定。

1.3 空氣樣品采集

將安德森6 級(jí)撞擊式采樣器置于豬舍中央，高度0.8 m，以5%的公綿羊血瓊脂培養(yǎng)基為采樣介質(zhì)，采集時(shí)空氣流量為28.3 L/min，采樣時(shí)間為10 min。

將AGI-30 空氣采樣器放在豬舍的中央，離地面1.0 m 處，以20 mL 無(wú)熱源的生理鹽水為采樣介質(zhì)，采樣時(shí)氣流速度為12.5 L/min，采樣時(shí)間為48 min。每棟豬舍采集4 個(gè)平行樣品。將其中兩個(gè)平行樣品混合并加入無(wú)熱源的生理鹽水定容至50 mL，該終溶液所代表的總空氣流量即為1 200 L 采集樣品；將其余兩個(gè)平行樣品混合同樣定容至50 mL。前處理完畢后，將每棟豬舍所采集的兩個(gè)生物氣溶膠溶液置于-20 ℃冰箱進(jìn)行保存，一份用于后續(xù)DNA 提取，另一份用于內(nèi)毒素的測(cè)定。

1.4 豬舍氣溶膠中需氧菌數(shù)量的測(cè)定

對(duì)每棟豬舍，安德森6 級(jí)撞擊式采樣器可采集6 種不同顆粒直徑范圍的氣溶膠，將已吸附氣溶膠樣品的6 個(gè)培養(yǎng)基置于恒溫箱中37 ℃需氧培養(yǎng)48 h，記錄需氧菌菌落數(shù)。將每棟豬舍中用安德森6 級(jí)采樣器采得的6 個(gè)瓊脂平板上的需氧菌菌落數(shù)代入ANDERSON 校正表進(jìn)行校正，計(jì)算出每棟豬舍所采集的6 節(jié)平皿上需氧菌菌落數(shù)量的校正總和。根據(jù)總通氣量（283 L），計(jì)算每立方米豬舍空氣中需氧菌的濃度。

1.5 豬舍氣溶膠DNA 提取和致病菌豐度的測(cè)定

表1 熒光定量微生物引物序列Table 1 Primer sequences used to measure pathogens abundances

1.6 豬舍氣溶膠中內(nèi)毒素含量的測(cè)定

對(duì)AGI-30 采集到的氣溶膠溶液解凍后，于428 r/min 離心10 min 并收集上清液用于內(nèi)毒素含量的測(cè)定。豬舍氣溶膠中內(nèi)毒素的測(cè)定采用酶標(biāo)儀和LAL 試劑盒進(jìn)行，測(cè)定步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)樣本和標(biāo)準(zhǔn)樣本在405～410 nm 波長(zhǎng)處的OD 值計(jì)算樣本中的內(nèi)毒含量，并根據(jù)總通氣量計(jì)算每立方米豬舍空氣中的內(nèi)毒素含量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

由于所有原始數(shù)據(jù)均不符合正態(tài)分布，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Log10 轉(zhuǎn)化后采用SAS 統(tǒng)計(jì)軟件中的Mixed程序分析差異顯著性，事后多重比較采用Turkey 法進(jìn)行。以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬舍類型對(duì)氣溶膠中需氧菌豐度的影響

由圖1可知，不同類型豬舍氣溶膠需氧菌數(shù)量存在顯著差異（P＜0.05）。保育舍來(lái)源的氣溶膠中需氧菌豐度顯著高于育肥舍、妊娠舍和分娩舍（P＜0.05），且保育舍氣溶膠需氧菌豐度分別是育肥舍、妊娠舍和分娩舍氣溶膠需氧菌豐度的3.28、3.44 和9.42 倍。此外，育肥舍和妊娠舍來(lái)源氣溶膠中需氧菌豐度顯著高于分娩舍（P＜0.05）。

圖1 豬舍類型對(duì)氣溶膠中需氧菌豐度的影響Figure 1 Effects of piggery types on aerobic bacterial abundance in aerosol

2.2 豬舍類型對(duì)氣溶膠中致病菌豐度的影響

由表2可知，豬舍類型對(duì)氣溶膠中致病菌Campylobacter 和E.coli 的數(shù)量有顯著的影響（P＜0.05）；保育舍來(lái)源的氣溶膠中Campylobacter 和E.coli 的數(shù)量顯著高于其他類型的豬舍（P＜0.05）；育肥舍、妊娠舍和分娩舍氣溶膠致病菌數(shù)量沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.3 豬舍類型對(duì)氣溶膠中內(nèi)毒素含量的影響

由圖2可知，不同豬舍類型氣溶膠內(nèi)毒素含量存在顯著差異（P＜0.05）。保育舍來(lái)源的氣溶膠中內(nèi)毒素含量顯著高于育肥舍、妊娠舍和分娩舍（P＜0.05）；育肥舍、妊娠舍和分娩舍氣溶膠內(nèi)毒素含量沒有顯著差異（P＞0.05）；保育舍氣溶膠內(nèi)毒素含量分別是育肥舍、妊娠舍和分娩舍氣溶膠內(nèi)毒素含量的5.56、3.63 和5.81 倍。

3 討論

全封閉式豬舍氣溶膠的微生物組成受諸多因素的影響，豬只生產(chǎn)階段和環(huán)境參數(shù)被報(bào)道可影響豬舍氣溶膠微生物的總菌數(shù)和細(xì)菌類群分布[6-7]。本試驗(yàn)采用平板培養(yǎng)的方法發(fā)現(xiàn)保育舍氣溶膠中需氧菌數(shù)顯著高于其他豬舍，而分娩舍氣溶膠中需氧菌數(shù)顯著低于其他豬舍。前人研究發(fā)現(xiàn)，豬舍的環(huán)境溫度和養(yǎng)殖密度對(duì)氣溶膠中需氧菌數(shù)有著顯著的影響，冬季全封閉高溫相對(duì)于夏季半封閉常溫豬舍氣溶膠中需氧菌的數(shù)量增加10 倍以上[9]，高密度養(yǎng)殖增加了豬舍空氣中需氧菌的總數(shù)[7]。在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，保育舍的環(huán)境溫度和養(yǎng)殖密度大于其他豬舍，這可能是本試驗(yàn)中保育舍需氧菌數(shù)高于其他豬舍的原因。而分娩舍的養(yǎng)殖密度是遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他類型豬舍的，這可能是本試驗(yàn)中分娩舍需氧菌數(shù)低于其他豬舍的原因。

表2 豬舍類型對(duì)氣溶膠中致病菌數(shù)量的影響Table 2 Effects of piggery types on pathogens abundances in aerosol log（拷貝數(shù)·m-3）

P.Y.Hong 等[7]在18 棟豬舍中氣溶膠中檢出了大量的彎曲桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌、腸球菌和大腸埃希菌，這些致病菌對(duì)人類及動(dòng)物的健康有著巨大的危害。因此，本研究進(jìn)一步比較了不同豬舍類型氣溶膠中上述致病菌的數(shù)量。在本研究中，保育舍氣溶膠中彎曲桿菌數(shù)量顯著高于其他豬舍。彎曲桿菌豐度與豬的生產(chǎn)性能負(fù)相關(guān)，且在未攝入抗生素的仔豬糞便中大量存在[10]。本試驗(yàn)中保育舍氣溶膠中最高豐度的彎曲桿菌可能與幼齡動(dòng)物更易攜帶該類致病菌有關(guān)，但有待進(jìn)一步研究證實(shí)。斷奶是豬一生中面臨的最大應(yīng)激事件之一，斷奶仔豬易受大腸埃希菌的感染導(dǎo)致腹瀉。H.B.Kim 等[8]研究表明斷奶仔豬糞便菌群中大腸埃希菌的豐度顯著高于其他生長(zhǎng)階段的豬只。與此一致，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，保育舍氣溶膠中大腸埃希菌數(shù)量顯著高于其他豬舍。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的成分，研究表明豬舍內(nèi)毒素的水平與革蘭氏陰性菌特別是大腸埃希菌的豐度顯著正相關(guān)[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，保育舍氣溶膠中內(nèi)毒素的水平顯著高于其他豬舍，這與其中較高豐度的大腸埃希菌有關(guān)。

圖2 豬舍類型對(duì)氣溶膠中內(nèi)毒素含量的影響Figure 2 Effects of piggery types on endotoxin concentration in aerosol

綜上，保育舍中致病菌數(shù)量和內(nèi)毒素水平顯著高于其他豬舍，提示保育舍中養(yǎng)豬從業(yè)人員和保育豬可能相比其他豬舍有著更大的健康隱患。進(jìn)一步的研究可以比較不同豬舍類型來(lái)源的環(huán)境顆粒物對(duì)人和動(dòng)物呼吸道以及全身健康的影響。

4 結(jié)論

豬舍類型對(duì)氣溶膠中致病菌數(shù)量和內(nèi)毒素含量有著顯著的影響，保育舍氣溶膠中總需氧菌、彎曲桿菌和大腸埃希菌數(shù)量以及內(nèi)毒素含量顯著高于其他豬舍。