林麝（Moschus moschiferus）FSHR基因的克隆及進化分析

歐陽菠，張 明，蔡永華，楊 營，鄭程莉，程建國，周 明，李 彪， 赟鐘 ，徐豐奕，楊建東*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，成都 611130；2.四川養(yǎng)麝研究所，成都 610016）

關(guān)鍵字：林麝；FSHR 基因；克??；進化分析

林麝（Moschus moschiferus）是國家一級保護動物，被列入中國瀕危動物紅皮書和瀕危動植物種國際貿(mào)易公約（CITES），在歷史上廣泛分布于中國的13 個省[1-2]，其中以四川、陜西數(shù)量最多[3]。然而，由于人類活動干擾，野生林麝數(shù)量從20世紀60年代末的一百多萬頭銳減至20世紀90年代末的20 萬頭左右[4]。為了拯救野外瀕危的種群，我國自從1958年就著手開展人工養(yǎng)麝繁育研究。目前，人工飼養(yǎng)林麝和活體取香已經(jīng)取得了一定的成果，林麝的圈養(yǎng)種群規(guī)模有所擴大，進而對野外種群的壓力起到了一定的緩解作用。盡管人工繁育林麝取得了一定成果，但是圈養(yǎng)種群數(shù)量還是有限，而且有關(guān)林麝生殖的遺傳機制也不清楚。

促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）是調(diào)控動物繁殖活動的重要激素之一，是垂體分泌的一種糖蛋白激素，對動物卵巢的生長，發(fā)育等起著必不可少的作用[5]。FSH 的生物學(xué)信息必須通過位于卵巢卵泡靶細胞上的促卵泡激素受體（follicle-stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR）的介導(dǎo)，才能發(fā)揮其生物學(xué)功能[6]。 FSHR 基因的研究始于Sprengel 等在老鼠中發(fā)現(xiàn)FSHR 基因[7]，隨后該基因被證明能影響FSH 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，且不同的FSHR 基因的多態(tài)性對于卵母細胞形成有顯著性影響[8]。 目前，在豬、牛、羊等家畜上已經(jīng)開展FSHR 基因的相關(guān)研究工作，發(fā)現(xiàn)基因的第1 和第10 個外顯子可以作為繁殖性能和生產(chǎn)性能的標(biāo)記基因[9-13]。因此，F(xiàn)SHR 基因可以作為常規(guī)選育中輔助選擇的分子標(biāo)記，幫助加快育種進程和更加具有目的性的對育種動物進行選育，減少選育優(yōu)良品種所需要的時間。

然而，迄今為止還未見有關(guān)林麝FSHR 基因的研究報道。 因此，本研究擬采用PCR 克隆測序的方法克隆林麝FSHR 基因，并運用進化分析的方法對其核苷酸序列結(jié)構(gòu)及其所編碼蛋白序列進行分析，從基因水平上比較不同物種FSHR 基因的差異，為進一步開展FSHR 基因的表達調(diào)控、 基因多態(tài)性等方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗樣品采自四川養(yǎng)麝研究所人工繁殖的雌性林麝耳緣組織80 只，樣本保存于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院動物繁殖實驗室。

1.2 林麝組織基因組DNA 提取

用滅菌的手術(shù)剪剪取40 mg 保存于無水乙醇中的林麝耳緣組織樣品，放入1.5 mL 的Eppendorf（EP）管中，盡量剪碎；然后加入800 μL 去離子水（TIANGEN）浸泡10 min，混合搖勻，離心，棄去上清液，重復(fù)3 次；加入1×TE 溶液置換2 次，以確保充分去除酒精。經(jīng)處理后的林麝耳緣組織DNA 提取按照常規(guī)酚/氯仿法提取，提取的DNA 用ND-2000 超微量核酸蛋白測定儀（Nanodrop，美國） 檢測其濃度。 -80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計與合成

引物設(shè)計主要根據(jù)NCBI 上已公布FSHR 基因的臨近物種家牛（Bos taurus，AC_000168.1）和綿羊（Ovis aries，NC_019460.1）的基因序列，利用primer5.0在基因外顯子上下游的保守區(qū)域設(shè)計特異性引物（表1），送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進行合成。

1.4 PCR 擴增及克隆測序

PCR 擴增反應(yīng)均在PE9700 型PCR 儀上完成。PCR 擴增體系：DNA 模板1.5 μL，正反向引物各0.5 μL，PCR 預(yù)混液（成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司）22.5 μL，共25 μL。 反應(yīng)程序為：98 ℃預(yù)變性4 min；98 ℃。 變性30 s，復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 kb/min，共計35 個循環(huán)，72 ℃終延伸8 min，4 ℃保存。

所得到的PCR 產(chǎn)物經(jīng)l.2%瓊脂糖凝膠電泳，使用Axygen 凝膠回收試劑盒回收純化目的條帶，采用pMDl8-T Vector 連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a，挑取陽性克隆，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切、PCR 鑒定后送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 序列分析

序列校對使用Chmmosoma 1.62、DNAStar 7.2等軟件。同源相似性及蛋白質(zhì)的預(yù)測采用DNAMAN軟件[15]。疏水性分析使用ExpASy protenomics 服務(wù)器（https：//www.expasy.org/proteomics）中的protscale 進行預(yù)測分析。 采用在線分析軟件HNN secondary structure predictionmethod（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html）

對林麝FSHR 基因蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。 采用MEGA5.0 軟件分析序列特征，計算序列間堿基對的差異信息[15]。 從GenBank 中下載了12 種動物的FSHR基因序列（表2），用MEGA5.0 構(gòu)建分子進化樹，采用的方法為NJ（neighbor-joining）及ME（minimum evolution）法，分支置信度采用自展（Bootstrap）檢驗法進行評價，自展檢驗重復(fù)次數(shù)為1 000 次。

表1 林麝FSHR 各段外顯子引物序列Table 1 Exon primer sequences of FSHR fragments in forest musk deer

表2 GenBank 上獲取的FSHR 序列信息Table 2 FSHR sequence information obtained on GenBank

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果和序列特征

將陽性重組質(zhì)粒送往成都擎科生物有限公司進行測序，測序結(jié)果經(jīng)過校對，拼接，除去質(zhì)粒載體及引物序列，得到林麝FSHR 基因序列（登錄號為：MG787948）。序列分析顯示林麝FSHR 含有10 個外顯子，長度為2 088 bp，CDS 區(qū)序列長度為1 971 bp，共編碼656 個氨基酸殘基（圖1）。A、T、G、C 的含量分別為25.57%、26.18%、20.70%和27.55%，A+T 含量為51.75%，G+C 含量為48.25%。

2.2 蛋白理化性質(zhì)分析

對林麝FSHR 蛋白預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)其分子質(zhì)量為73.78 kDa，理論等電點（PI）為6.77，在pH=7.0 的條件下的帶電荷量-2.27。 疏水性分析結(jié)果表明，林麝FSHR 蛋白的氨基酸殘基大部分為疏水蛋白殘基，其總平均疏水性系數(shù)（GRAVY）為0.203。

2.3 FSHR 基因同源性分析

FSHR 基因同源性分析顯示，林麝FSHR 基因編碼區(qū)序列與家牛、印度水牛、藏羚羊、綿羊、白尾鹿、家馬、雙峰駱駝、單峰駱駝、野豬、家犬、家貓、原雞的同源性分別為96.1%、95.9%、95.4%、95.3%、95.0%、92.3%、91.3%、91.2%、90.2%、91.2%、90.8%、71.2%（表3）。

2.4 FSHR 基因進化分析

根據(jù)所得核苷酸序列，通過NJ（neighbor-joining）法與ME（minimum evolution）法（圖2）進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建，結(jié)果顯示根據(jù)NJ 樹構(gòu)建的進化樹，林麝FSHR 基因與家牛、羊、鹿的親緣關(guān)系最近，與原雞親緣最遠。此外，通過使用ME 法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果與NJ 法所構(gòu)建的進化樹一致。

3 討論與結(jié)論

圖1 林麝FSHR 基因CDS 序列及由此推導(dǎo)的氨基酸序列Figrue 1 The CDS sequence of the FSHR gene in the musk deer and its deduced amino acid sequence

圖2 林麝與其他12 個物種FSHR 基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Figure 2 Phylogenetic tree constructed from the musk deer and other 12 species of FSHR genes

繁殖相關(guān)功能基因選擇在動物育種當(dāng)中起到了極其重要的作用，可以為動物選育提供重要信息[16-17]。FSHR 基因的結(jié)構(gòu)和功能可以顯著的影響FSH 的活性從而對動物的繁殖性能形成顯著地影響[18]。 我們的研究表明林麝的FSHR 基因的開放閱讀框由10個外顯子組成。序列分析表明林麝與牛、綿羊等哺乳動物的FSHR 基因結(jié)構(gòu)基本一致[19-20]。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示林麝先與?？苿游锖蠟橐恢?，后與綿羊等相聚合，其結(jié)果與前人研究一致[21-22]。整個基因樹的拓撲結(jié)構(gòu)也與這12 個物種的生物學(xué)分類上的拓撲結(jié)構(gòu)是一致的，這些結(jié)果表明FSHR 基因或許可作為系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系研究的有效候選基因之一。 通過對比研究發(fā)現(xiàn)，林麝的FSHR 基因及其編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)、序列特征、 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與黃牛，山羊等哺乳動物的FSHR 基因生物信息極為相似[21，23-24]，說明FSHR 基因及其編碼產(chǎn)物具有較強的保守性。

目前，在豬、牛、羊等家畜上已經(jīng)開展FSHR 基因的相關(guān)研究工作，發(fā)現(xiàn)山羊的FSHR 基因的5’UTR 區(qū)多態(tài)性與其的產(chǎn)仔數(shù)有極顯著的關(guān)聯(lián)[10]，小梅山豬FSHR 基因的第1 外顯子的多態(tài)性與其產(chǎn)仔數(shù)具有相關(guān)性[9]，牛的FSHR 基因的第10 個外顯子與牛的雙胎性狀具有相關(guān)性[25]，但是不同物種上FSHR 對其繁殖性能的影響并不是在同一SNP 位點，正因為如此，F(xiàn)SHR 基因被很多學(xué)者當(dāng)成是影響畜禽繁殖性能的一個重要候選基因展開相關(guān)研究，有關(guān)林麝繁殖候選功能基因的研究很少，僅王勤等人報道過林麝促卵泡激素和促黃體激素基因的克隆及其序列分析的研究[26]。 本研究通過林麝FSHR 基因的克隆和分析，獲得了林麝FSHR 基因序列并預(yù)測了其蛋白質(zhì)氨基酸的部分理化性質(zhì)及特性，為進一步從分子水平上揭示FSHR 基因在林麝上的作用機制及其影響林麝麝香產(chǎn)量及繁殖性能的機理奠定了基礎(chǔ)，擴展了林麝研究的領(lǐng)域，為以后在分子水平上進行林麝選種，提高麝香產(chǎn)量及進一步開展林麝相關(guān)功能基因的表達機制的研究提供了一定的參考數(shù)據(jù)。