冷藏對蝦中腐敗希瓦氏菌活菌EMA-qPCR檢測方法的建立

肖 玲，唐廷廷，李美良，韓國全*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014； 2.重慶三峽職業(yè)學(xué)院，重慶 萬州 404155）

腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）屬于希瓦氏菌科、希瓦氏菌屬，為革蘭氏陰性菌，兼性厭氧，是冷鏈流通過程中高蛋白食品中的主要腐敗菌[1]。該菌能還原魚類等水產(chǎn)生物肌肉中的氧化三甲胺（trimethylamineoxide，TMAO），生成二甲胺（dimethylamine，DMA）和甲醛（formaldehyde，F(xiàn)A），并產(chǎn)生H2S，從而導(dǎo)致水產(chǎn)品的腐敗，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。腐敗希瓦氏菌也是人類潛在病原菌，能導(dǎo)致人軟組織感染、肺炎和心內(nèi)膜炎等疾病[3-5]。

食品中腐敗希瓦氏菌傳統(tǒng)鑒定首先需用培養(yǎng)基分離，再進(jìn)行生化鑒定，整個周期過長，且由于培養(yǎng)基的敏感性、生化反應(yīng)的穩(wěn)定性等因素嚴(yán)重影響了腐敗希瓦氏菌的檢出率和準(zhǔn)確性[6-7]。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，普通PCR 和實時熒光PCR被用于細(xì)菌等微生物的快速鑒定。但普通PCR 和實時熒光PCR 也能擴(kuò)增死菌或自由狀態(tài)的DNA，進(jìn)而導(dǎo)致腐敗希瓦氏菌活菌檢驗時假陽性的產(chǎn)生[8]。因此，迫切需要一種特異、準(zhǔn)確、快速檢測腐敗希瓦氏菌活菌的新檢測方法。有文獻(xiàn)報道指出疊氮溴乙錠（EMA）能夠選擇滲透進(jìn)入死細(xì)胞，在光作用下與死細(xì)胞內(nèi)的DNA 發(fā)生共價不可逆的結(jié)合，從而抑制死細(xì)胞DNA 的PCR 擴(kuò)增，但對活細(xì)胞DNA 影響甚微，能夠有效降低普通PCR 和實時熒光PCR 檢測時的假陽性[6,9]。

EMA-qPCR 技術(shù)已被證實在細(xì)菌活菌診斷上具有極好的穩(wěn)定性與應(yīng)用價值，但目前尚無關(guān)于該技術(shù)在腐敗希瓦氏菌的研究及應(yīng)用報道[8]。本研究旨在將EMA 與實時熒光PCR 技術(shù)相結(jié)合，建立一種特異、準(zhǔn)確、快速檢測食物中腐敗希瓦氏菌活菌的檢測方法。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株

腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens，ATCC BAA-1097）、擬態(tài)弧菌（Vibiro mimicus，ATCC 33653）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，ATCC 19111）、副溶血弧菌（Vibrio Parahemolyticus，ATCC 33847）、鮑希瓦氏菌（Shewanella haliotis，ATCC 49138）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，ATCC 12228）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，ATCC25923）、鼠傷寒沙門菌（Salmonellatyphimurium，ATCC 13311）、糞鏈球菌（Escherichia faecalis，ATCC 8043）、乙型溶血性鏈球菌（Streptococcus pyogens，ATCC 32210）購于中國微生物菌種保藏中心；蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus，CMCC 63303）、大腸埃希菌（Escherichia coli，M-2-7）購于中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 主要試劑

疊氮溴乙錠（EMA），Biotium 公司（美國）；SYBR Premix Ex TaqTMII 試劑盒，TaKaRa 公司（中國）；LB培養(yǎng)基，上海依赫生物科技有限公司（中國）；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（DP302），天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 腐敗希瓦氏菌活菌和死菌的制備

取腐敗希瓦氏菌（ATCC BAA-1097）接種LB 固體培養(yǎng)基，25 ℃，培養(yǎng)24～36 h 后，挑取單菌落，接種到LB 液體培養(yǎng)基中，在25 ℃，250 r/min 振蕩過夜培養(yǎng)，經(jīng)革蘭氏染色驗純后，用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌懸液濃度為1×107CFU/mL，即為活菌懸液[10]。結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果，活菌懸液于100 ℃水浴加熱10 min，可獲得死菌懸液。

1.2.2 引物及熒光定量PCR 反應(yīng)條件

選擇腐敗希瓦氏菌的gyrB 基因序列（登錄號：NC_009438.1），用DNAMAN 軟件設(shè)計特異性引物。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。引物序列如下：上游引物（gyrB F）5′-GACGAACCAGCACTGACTCAATACCT-3′；下游引物（gyrB R）5′- GCCATCTAACGCCGCACCTAACTTG-3′。PCR 反應(yīng)體系為25 μL：2×Taq PCR Mastermix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 補足體積為25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，30 個循環(huán)。qRT-PCR 擴(kuò)增完成后分析熔解曲線。如果Ct 值≤35 則判定為陽性，Ct 值＞35 或無Ct 值判定為陰性。

1.2.3 EMA 作用濃度和作用時間的優(yōu)化

取16 支無菌EP 管，按1 mL/支，分別加入濃度均為1×107CFU/mL 的腐敗希瓦氏菌死菌液8 支和活菌液8 支?；罹退谰M，均依次避光分別加入0、5、10、15、20、25、30、40 μg/mL 的EMA，室溫靜置5 min，將EP 管置于冰上距離鹵素?zé)魺艄?5 cm 處垂直照射5 min。取200 μL 進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增。

相同方法把40 μg/mL 的EMA 與腐敗希瓦氏菌死菌液和活菌液混合，分別室溫靜置0、5、10、15、20 min，取200 μL 進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增。

1.2.4 最低檢出限和對死菌抑制率檢測

采用麥?zhǔn)媳葷岱?，?0 倍稀釋，制備濃度依次為1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101CFU/mL 的腐敗希瓦氏菌活菌液，各取200 μL 進(jìn)行EMA 實時熒光PCR 擴(kuò)增，以確定該方法的最低檢出限。

取1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1 CFU/mL 的腐敗希瓦氏菌，經(jīng)100 ℃水浴加熱10 min。按上述方法進(jìn)行EMA-qPCR 擴(kuò)增，確定該方法對死菌DNA 抑制率。

1.2.5 EMA-qPCR 在死活菌混合體系中的選擇性擴(kuò)增

以固定數(shù)量的死細(xì)胞（1×104CFU）分別與不同數(shù)量的活細(xì)胞（1×106、1×105、1×104、1×103、1×102和1×101CFU）混合形成不同死、活細(xì)胞比例的混合菌液。用優(yōu)化的EMA 濃度和時間處理菌液。取200 μL進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增。

1.2.6 特異性驗證

選用腐敗希瓦氏菌、蠟樣芽胞桿菌、擬態(tài)弧菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、鮑希瓦氏菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌 鼠傷寒沙門菌和糞鏈球菌進(jìn)行EMA-qPCR 擴(kuò)增，驗證方法的特異性。

1.2.7 冷藏對蝦中腐敗希瓦氏菌的EMA-qPCR 擴(kuò)增

在四川成都某3 個大型超市和一個水產(chǎn)品銷售門市部共采集冷藏南美白對蝦101 尾。無菌操作，采集樣品軀干部肌肉和肝胰腺，按1∶5 加入無菌生理鹽水，冰水浴條件下，組織勻漿機(jī)打碎，4 000 r/min離心10 min，取上清液。將上清液分為3 部分：第1部分取0.1 mL 涂布于LB 培養(yǎng)板，25 ℃培養(yǎng)24～48 h，進(jìn)行平板計數(shù)，每個樣本做3 個平行；第2 部分上清按照1.2.3 中優(yōu)化方法，經(jīng)EMA 及鹵素?zé)艄庹仗幚砗螅∵m量進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增；第3 部分上清不做任何處理直接進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增。

1.2.8 細(xì)菌16S rDNA 鑒定

分離純化1.2.7 平板生長的優(yōu)勢細(xì)菌，挑取純化后的單菌落，加入含100 μL 無菌水的EP 管中混勻，參照細(xì)菌DNA 提取試劑盒說明書，提取細(xì)菌DNA 作為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物序列：F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，R：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'。PCR 反應(yīng)體系：DNA 模板2 μL，上下游引物各1 μL、Taqmix 12.5 μL、ddH2O補足至25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃變性5 min，94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳完成后凝膠照相儀照相，根據(jù)條帶大小，選擇符合要求的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。測序由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成。在NCBI 上將測序結(jié)果序列進(jìn)行BLAST 比對，同源性≥95%為同一種細(xì)菌。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 20.0 對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。兩組之間比較采用獨立樣本t 檢驗，3 組間比較用單因素方差分析（ANOVA-LSD），以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMA 作用濃度和作用時間的優(yōu)化結(jié)果

用不同濃度EMA 處理腐敗希瓦氏菌死活菌（濃度為1×107CFU/mL）30 min，篩選最佳EMA 濃度。Ct 值表示循環(huán)閾值，Ct 越低，說明細(xì)菌DNA 濃度越高。檢測結(jié)果如圖1A 所示，用0、5 和15 μg/mL EMA 處理30 min，死菌的Ct 值分別為19.56±0.06、21.13±0.23 和25.54±0.15，當(dāng)EMA 濃度在20～40 μg/mL時，無Ct 值，表明死菌DNA 被徹底抑制。在EMA濃度為0～40 μg/mL 范圍內(nèi)，活菌Ct 值從20.90～23.32，表明在EMA 濃度≤35 μg/mL 范圍內(nèi)，EMA濃度對活菌Ct 值影響不大。綜合考慮，選擇EMA 的濃度為20 μg/mL。

用20 μg/mL 的EMA 分別處理腐敗希瓦氏菌死活菌0、5、10、15、20、25 min。死菌擴(kuò)增的Ct 值呈時間依賴性增加，與對照組相比，各時間點Ct 值均具有顯著性差異（P＜0.05，在20 min 后，Ct 值無顯著性變化，表明死菌DNA 的擴(kuò)增被完全抑制。20 μg/mL的EMA 在0～20 min 內(nèi)對活菌Ct 值均小于20，且各組之間無顯著性差異（P＞0.05），見圖1B。綜合考慮成本與效率，選擇EMA 的作用時間為20 min。

圖1 EMA 作用濃度和作用時間的優(yōu)化結(jié)果Figure 1 Optimization of EMA concentration and irradiating times

2.2 EMA-qPCR 對活菌最低檢出限結(jié)果

分別對濃度為1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101CFU/反應(yīng)的腐敗希瓦氏菌活菌進(jìn)行EMA-qPCR 檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在活菌數(shù)為1×101～1×107CFU 范圍內(nèi)，Ct 值與對應(yīng)活菌數(shù)目的對數(shù)值（X）呈良好的線性關(guān)系，Ct=-3.37X+32.47，相關(guān)系數(shù)為0.996 6，見圖2。通過Ct 值直接可以計算qPCR 中的活菌數(shù)目，方法的最低檢出限濃度為1 CFU/反應(yīng)。

圖2 EMA-qPCR 對活菌檢測結(jié)果Figure 2 The results of EMA-qPCR for the detection of viable bacteria

2.3 EMA-qPCR 對死菌抑制結(jié)果

分別對腐敗希瓦氏菌死菌1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1 CFU/反應(yīng)進(jìn)行EMA-qPCR 檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1×106CFU/反應(yīng)死菌的Ct 值為33.55±0.55。其余死菌Ct 值在35.33±0.72 到無Ct 值。因此，該方法對死菌的最高抑制濃度為1×105CFU/反應(yīng)。

2.4 EMA-qPCR 在死活菌混合體系中的選擇性擴(kuò)增結(jié)果

將1×104CFU 的死細(xì)胞與1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101CFU 活細(xì)胞混合后，加入EMA，使其終濃度為20 μg/mL。結(jié)果發(fā)現(xiàn)死菌DNA 被徹底抑制，隨著活菌濃度的降低，Ct 值逐漸增大，具體結(jié)果見圖3。

圖3 死、活細(xì)胞混合體系的EMA-qPCR 擴(kuò)增Figure 3 The amplication of mixed bacteria by EMA-qPCR

2.5 特異性驗證結(jié)果

對10 株細(xì)菌進(jìn)行EMA-qPCR 進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示腐敗希瓦氏菌的擴(kuò)增Ct 值27.31±0.07，其它細(xì)菌Ct 值均大于35。圖4為部分細(xì)菌擴(kuò)增結(jié)果。

2.6 EMA-qPCR 在冷藏對蝦樣品中的應(yīng)用

對采集的101 尾冷藏南美白對蝦均分別用平板培養(yǎng)法，qPCR 法和EMA-qPCR 法檢測腐敗希瓦氏菌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)平板培養(yǎng)法、qPCR 法和EMA-qPCR法分別在19、16 和12 尾對蝦中檢測到腐敗希瓦氏菌。其中，3 種檢測方法均分別在相同12 尾對蝦中（第3、10、17、18、33、42、56、63、75、86、93 和97 號）檢測到腐敗希瓦氏菌；qPCR 法和EMA-qPCR 法在另外4 尾對蝦中（第6、27、69 和89 號）均檢測到腐敗希瓦氏菌；還有3 尾對蝦（第52、65 和80 號），僅qPCR 檢測到腐敗希瓦氏菌陽性。本研究結(jié)果表明建立的EMA-qPCR 法與平板培養(yǎng)法相比，靈敏度更高；與qPCR 法相比，能減少腐敗希瓦氏菌活菌檢測的假陽性。

表1 不同濃度的腐敗希瓦氏菌死菌EMA-qPCR 檢測結(jié)果Table 1 Detection results of dead S.putrefaciens of ferent concentrations by EMA-qPCR

圖4 腐敗希瓦氏菌EMA-qPCR 檢測技術(shù)特異性檢測結(jié)果Figure 4 Results of detection specificity for S.putrefaciens by using EMA-qPCR

3 討論與結(jié)論

腐敗希瓦氏菌廣泛分布在自然界，特別是在水生環(huán)境，如海洋、淡水及水產(chǎn)生物中，是高蛋白食品常見的特定腐敗菌[11]。近年來，隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，居民生活水平的也顯著提高，低脂肪和高蛋白的水產(chǎn)品越來越受到人們的喜愛。如此大大加劇了腐敗希瓦氏菌的感染率。因此，水產(chǎn)品中腐敗希瓦氏菌的快速、準(zhǔn)確鑒定極為重要。目前對腐敗希瓦氏菌鑒定的方法主要包括平板分離培養(yǎng)和PCR鑒定[12]。平板分離培養(yǎng)雖然操作簡單，但周期較長，特異性低[13]。普通PCR 或熒光定量PCR 雖然周期短，靈敏度較高，但由于腐敗希瓦氏菌死菌DNA 能在食品中保存很長時間[14]，在進(jìn)行PCR 反應(yīng)時死菌DNA 也被擴(kuò)增，容易導(dǎo)致PCR 鑒定假陽性。從食品安全角度考慮，存活的腐敗菌較死菌有更強(qiáng)的擴(kuò)散及傳播風(fēng)險，尤其對于生食水產(chǎn)品而言，活菌的定量檢測具有十分重要的意義，需要建立一種高效、準(zhǔn)確、快速的活菌檢測方法。

EMA 能夠選擇性的進(jìn)入死細(xì)胞，而不能進(jìn)入細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞。EMA 能在光刺激作用下與DNA 結(jié)合，抑制DNA 的擴(kuò)增。將EMA 與傳統(tǒng)PCR或qPCR 結(jié)合可以選擇性的僅擴(kuò)增活菌DNA，從而快速、準(zhǔn)確的區(qū)分死菌和活菌，有效降低傳統(tǒng)PCR或qPCR 檢測產(chǎn)生的假陽性。EMA-qPCR 檢測技術(shù)已被用于食品和環(huán)境中部分病原菌的檢測[15-16]，但對腐敗希瓦氏菌的檢測還沒有被報道。

本研究首先用腐敗希瓦氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行了EMA-qPCR 方法的建立。研究結(jié)果表明當(dāng)EMA 濃度為20 μg/mL，作用時間為20 min 時，EMA 能夠徹底抑制1×107CFU/mL 腐敗希瓦氏菌死菌DNA 的擴(kuò)增。張俊彥等[6]建立了食品中單增李氏特菌活菌的EMA-qPCR 檢測方法，其方法對單增李氏特菌活菌的最低檢出限為54 CFU，本檢測方法的最低檢出限為1 CFU，表明該方法靈敏度較高。EMA-qPCR對死菌抑制實驗顯示能夠抑制最高濃度為1×105CFU/反應(yīng)的死菌DNA 擴(kuò)增。qPCR 雖然能夠快速檢測食品中細(xì)菌的含量，但由于死菌DNA 不能完全降解，因此，在進(jìn)行qPCR 檢測活菌含量時，往往導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生。EMA 作為一種核酸染料，在光作用下與死細(xì)胞內(nèi)的DNA 發(fā)生共價不可逆的結(jié)合，可以減少PCR 擴(kuò)增時假陽性的產(chǎn)生。本研究死菌和活菌混合實驗結(jié)果表明，對于不同比例的死活菌，EMA 能夠抑制死菌DNA 擴(kuò)增，但對活菌DNA 擴(kuò)增無影響。表明建立的方法能對混合體系中的活菌數(shù)進(jìn)行快速定量。特異性驗證實驗中腐敗希瓦氏菌Ct為27.31±0.07，其余9 株細(xì)菌擴(kuò)增的Ct 均大于35，說明該方法特異性良好。黃新新等[17]用另一種核酸染料疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）聯(lián)合qPCR 建立了冷凍食品中副溶血孤菌的檢測方法，發(fā)現(xiàn)PMA-qPCR 既能有效抑制對死菌的擴(kuò)增，又能克服傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法的漏檢缺陷。本研究對101 尾冷藏南美對蝦樣品檢測結(jié)果顯示，建立的EMA-qPCR 也能克服傳統(tǒng)平板分離培養(yǎng)法的漏檢缺陷。與普通qPCR 相比，又能減少腐敗希瓦氏菌活菌檢測時的假陽性。

綜上所述，本研究建立了基于EMA-qPCR 的冷藏對蝦腐敗希瓦氏菌活菌檢測新方法，可及時、準(zhǔn)確的定量檢測水產(chǎn)品等食品中的腐敗希瓦氏菌，能夠預(yù)警水產(chǎn)食品被活腐敗希瓦氏菌污染程度，輔助評價食品安全質(zhì)量，減少人類因誤食或因直接創(chuàng)口接觸感染導(dǎo)致的疾病發(fā)生。