利用16個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析6個(gè)鴨品種的遺傳多樣性

王統(tǒng)苗，常國(guó)斌，白 皓，江 勇，張 揚(yáng)，王志秀，張 莘，劉本帥，陳國(guó)宏*

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院/教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009）

DNA 分子標(biāo)記是一種經(jīng)典的遺傳標(biāo)記，在分子遺傳學(xué)上廣泛應(yīng)用，目前微衛(wèi)星是一種普遍使用的分子遺傳學(xué)標(biāo)記，具有共顯性、多態(tài)性高、易于鑒定等優(yōu)點(diǎn)，在構(gòu)建遺傳圖譜、QTL 定位、分子遺傳多樣性研究[1-2]等方面都有普遍應(yīng)用。我國(guó)是世界上鴨品種遺傳資源最為豐富的國(guó)家，但是由于外來品種的大量引入和雜交，使許多地方品種資源急劇減少，我國(guó)地方鴨品種資源的保種情況不容樂觀。而遺傳多樣性的研究能為鴨品種資源的有效利用和優(yōu)良品種的培育提供依據(jù)?，F(xiàn)在已有多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)被用于鴨品種的遺傳多樣性研究。吳艷等[3]利用4 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了6 個(gè)鴨品種（紹鴨、番鴨、櫻桃谷鴨、北京鴨Z4、北京鴨Z1 和奧白星鴨）之間的關(guān)系并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，為我國(guó)地方品種資源的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)；張燕等[4]利用3 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了4 個(gè)番鴨品系的遺傳多樣性，以便為選育和配套系雜交利用提供基礎(chǔ)；張揚(yáng)等[5]用12 對(duì)熒光標(biāo)記的微衛(wèi)星引物對(duì)福建省5 個(gè)地方鴨品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)5 個(gè)地方鴨品種并不是按照地理距離進(jìn)行聚類。

本研究首次在鴨品種遺傳多樣性分析中加入了2018年最新發(fā)現(xiàn)的遺傳資源：于田麻鴨（北方）和獨(dú)特觀賞價(jià)值兼肉用、藥用價(jià)值的潤(rùn)州鳳頭白鴨[6]，同時(shí)選取中國(guó)肉鴨代表品種北京鴨、櫻桃谷鴨、藥用品種連城白鴨[7]，肉蛋兼用型品種吉安紅毛鴨[8]（南方）。為闡明于田麻鴨和潤(rùn)州鳳頭白鴨遺傳多樣性狀況，采用改進(jìn)毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)這6 個(gè)鴨品種的16 個(gè)微衛(wèi)星座位進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比分析6 個(gè)鴨品種的遺傳結(jié)構(gòu)和相互關(guān)系，揭示于田麻鴨和潤(rùn)州鳳頭白鴨的遺傳特征，為地方鴨品種資源開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本采集

6 個(gè)地方祖代鴨品種分別是潤(rùn)州鳳頭白鴨（鎮(zhèn)江天成農(nóng)業(yè)科技有限公司）、連城白鴨（福建省石獅國(guó)家級(jí)水禽基因庫(kù)）、櫻桃谷鴨（江蘇益客集團(tuán)）、北京鴨（北京畜牧獸醫(yī)研究所）、吉安紅毛鴨（江西省吉安紅毛鴨資源保種場(chǎng)）、于田麻鴨（新疆于田縣），公母各15 只。

1.2 鴨基因組DNA 提取

于鴨翅靜脈處采血約2 mL，提取基因組總DNA 用傳統(tǒng)酚-氯仿法[9]，并且用ND-1000 蛋白核酸測(cè)定儀測(cè)定濃度和純度，稀釋到100 ng/L，于-20 ℃保存。

1.3 微衛(wèi)星位點(diǎn)

根據(jù)文獻(xiàn)[10-12]提供的16 對(duì)微衛(wèi)星座位AJ272580、AJ515884、CMO11、AY493256、CMO12、AJ515898、AY493249、AJ515893、SMO13、AJ515895、AJ272578、SMO4、AJ272579、AY493295、AJ272577、APL2 作為試驗(yàn)位點(diǎn)。所選位點(diǎn)均表現(xiàn)為多態(tài)性良好，試驗(yàn)所用引物均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。所用16 對(duì)微衛(wèi)星引物標(biāo)記類型及退火溫度見表1。

1.4 PCR 反應(yīng)體系與產(chǎn)物擴(kuò)增

PCR 反應(yīng)體系：Taq Master Mix(Dye Plus)10 μL，超純水7 μL，10 pmol/μL 上下游引物各1 μL，100 ng/L DNA 模板1.0 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，53～63 ℃退火30 s（因座位而異），72 ℃延伸30 s，共32 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.5 STR 分型測(cè)序

將熒光PCR 產(chǎn)物送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，用ABI-3730XL 全自動(dòng)測(cè)序儀做STR 分型測(cè)序。上樣總體積為11.5 μL，其中上樣液Hi-Di Formamide10 μL，GS-Size Standard（標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參）0.5 μL，混合PCR 產(chǎn)物1 μL。將Hi-Di Formamide 與GS-500 Size Standard 均勻混合后加入到等量混合好的PCR 產(chǎn)物中，加樣到96 孔板，變性然后上機(jī)進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

GeneMapper 4.0 軟件自動(dòng)生成獨(dú)立的圖譜文件并讀出、峰值的大小、片段長(zhǎng)度的大小、峰面積的大小，同時(shí)判斷純合子（單峰）或雜合子（雙峰）。利用Microsatellite-Toolkit 軟件計(jì)算等位基因頻率、期望與觀察雜合度，根據(jù)D.Botstein 等[13]的公式計(jì)算多態(tài)信息含量。

1.7 聚類方法

本文采用了UPGMA 聚類方法，以奈氏遺傳距離（DA）為依據(jù)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)記引物

選擇等位基因豐富并且符合要求的座位：AJ27 2580、AJ515884、AJ515893、AY493256、AY493249、AY493295、CMO12、SMO13、AJ272578、APL2、AJ515 898、AJ272579、SMO4、AJ272577、CMO11、AJ515895，共計(jì)16 個(gè)。根據(jù)文獻(xiàn)[9-11]中的基因大小，將16 個(gè)位點(diǎn)分為6 個(gè)組合（組內(nèi)引物擴(kuò)增長(zhǎng)度無重疊或相差大于50 bp），所選引物的其中一條（上游或者下游）的5'端，分別用熒光染料FAM，HEX 進(jìn)行標(biāo)記。最終獲得的16 個(gè)SSR 座位及其最優(yōu)化條件見表1。

表1 16 對(duì)熒光引物的最優(yōu)化反應(yīng)條件Table 1 The optimize reaction conditions of 16 pairs fluorescence primers

2.2 熒光PCR 產(chǎn)物的STR 分型

基于ABI-3730XL 型DNA 測(cè)序平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行掃描。部分位點(diǎn)的擴(kuò)增分型效果見圖1。

圖1 潤(rùn)州鳳頭白鴨A04 個(gè)體在AJ272579 位點(diǎn)的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物STR 分型結(jié)果Figure 1 STR genotyping result of AJ272579 locus of Crested White Duck individual A04

2.3 所選SSR 座位的遺傳多樣性

16 對(duì)熒光SSR 引物在個(gè)體層面上的遺傳學(xué)參數(shù)見表2，16 對(duì)引物在6 個(gè)群體中共檢測(cè)到141 個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)8.8 個(gè)，有5 個(gè)位點(diǎn)的等位基因型均超過10 個(gè)，其中AY493295 位點(diǎn)檢測(cè)到的等位基因最多，為13 個(gè)。6 個(gè)鴨品種各個(gè)微衛(wèi)星基因座的有效等位基因數(shù)的變化范圍為1.112 1～3.892 0，其中基因座AY493256 的有效等位基因數(shù)最多，達(dá)3.892 0。而最少的是基因座SMO13，只有1.112 1個(gè)。16 個(gè)座位均為中高度多態(tài)位點(diǎn)，其中CMO11、AJ515898、AJ51893、SMO13、AJ27257、AJ272579、AJ272577 等7 個(gè)座位為中度多態(tài)位點(diǎn)，其他9 個(gè)座位為高度多態(tài)位點(diǎn)。

2.4 16 個(gè)微衛(wèi)星基因座在各品種中的多態(tài)信息含量（PIC）、有效等位基因數(shù)（Ne）和群體雜合度（H）

從表3可以看出，基因座AY493256 的多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù)及群體雜合度最高，基因座SMO13 最低，說明基因座AY493256 變異最大，基因座SMO13 變異最小。從不同群體來看，櫻桃谷鴨的多態(tài)信息含量最高，其次是于田麻鴨、北京鴨、吉安紅毛鴨、連城白鴨，而潤(rùn)州鳳頭白鴨最低；吉安紅毛鴨的有效等位基因數(shù)最多，潤(rùn)州鳳頭白鴨最少；于田麻鴨群體雜合度最大，潤(rùn)州鳳頭白鴨最小。由表3可以得出潤(rùn)州鳳頭白鴨的遺傳變異最小。

表2 16 對(duì)SSR 引物的遺傳學(xué)參數(shù)Table 2 Genetic parameters of 16 pairs of SSR primers

表3 16 個(gè)微衛(wèi)星基因座在各品種中的多態(tài)信息含量（PIC）、有效等位基因數(shù)（Ne）和群體雜合度（H）Table 3 Polymorphism information content，the number of effective alleles and heterozygosisty of 16 microsatellite loci in each breeds

（續(xù)表3）

2.5 6 個(gè)鴨群體間的聚類分析

從圖2中可以看出，這6 個(gè)鴨品種總共分為兩大類，潤(rùn)州鳳頭白鴨先與于田麻鴨聚為一類，再與連城白鴨聚為一類。潤(rùn)州鳳頭白鴨和于田麻鴨都從野鴨進(jìn)化而來，潤(rùn)州鳳頭白鴨與連城白鴨都是白羽鴨，因此聚為一類；北京鴨先與櫻桃谷鴨聚為一類，再與吉安紅毛鴨聚為一類。北京鴨與櫻桃谷鴨都是北方鴨種，且都是肉用型鴨。

3 討論與結(jié)論

3.1 各品種的樣本量

圖2 基于Da 遺傳距離構(gòu)建的6 個(gè)群體的UPGMA 聚類圖Figure 2 Phylogenetic tree of 6 duck breeds by UPGMA based on Da genetic distance

利用SSR 標(biāo)記進(jìn)行群體遺傳多樣性分析，對(duì)群體中個(gè)體樣本量有一定要求。本研究中6 個(gè)鴨品種的樣本量為30，對(duì)于品種的遺傳特性的分析，樣本量偏少。要想更深入的研究6 個(gè)品種之間的遺傳關(guān)系，還需擴(kuò)大樣本量。

3.2 群體的遺傳多樣性

遺傳雜合度（H），又稱基因雜合度，是體現(xiàn)品種內(nèi)遺傳變異的一個(gè)重要指標(biāo)[14]。本研究得出，6 個(gè)鴨品種在微衛(wèi)星座位的平均雜合度在0.385 4～0.518 7，在中等范圍，表明本研究群體的遺傳變異程度適中。D.Botstein 等[13]首先提出了用多態(tài)信息含量指標(biāo)（PIC）來衡量遺傳變異程度；PIC 含量越大，在一個(gè)群體中該位點(diǎn)雜合子比例就越大，所提供的遺傳信息就越高。本研究結(jié)果表明，所選的16 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記中除CMO11、AJ515898、AJ51893、SMO13、AJ272578、AJ272579、AJ272577 等7 個(gè)座位為中度多態(tài)位點(diǎn)（0.25＜PIC＜0.50）其他9 個(gè)座位為高度多態(tài)位點(diǎn)（PIC＞0.50）?？勺鳛橛行У倪z傳標(biāo)記用于鴨品種間遺傳多樣性分析和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的分析。

3.3 關(guān)于群體的聚類分析

遺傳距離是體現(xiàn)各品種間遺傳差異程度的重要指標(biāo)。M.Nei[15]在1983年用有限等位基因模型（Infinite Allele Model，IAM）來進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬時(shí)，發(fā)現(xiàn)Da 比其他遺傳距離更準(zhǔn)確地得出系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。本研究基于Da 遺傳距離構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。從系統(tǒng)發(fā)育樹來看，潤(rùn)州鳳頭白鴨、于田麻鴨、連城白鴨聚為一類。于田麻鴨是新疆地方品種，是由野鴨自然交配而形成，通過長(zhǎng)期選育選配而成的具有優(yōu)良生產(chǎn)性能的優(yōu)良地方品種，和潤(rùn)州鳳頭白鴨聚為一類，因?yàn)檫@兩個(gè)鴨品種都是由野鴨進(jìn)化而來。潤(rùn)州鳳頭白鴨和連城白鴨都是南方鴨種，羽色都為白色，這可能使它們聚為一類。

北京鴨先與櫻桃谷鴨聚為一類，再與吉安紅毛鴨聚為一類。櫻桃谷鴨是北京鴨與英國(guó)當(dāng)?shù)仄贩N雜交而培育出來的新品種，含有大部分北京鴨的血液，且是肉用型的品種[3]，所以它們聚為一類，與鄢緋寰等[16]、肖天放等[17]的研究結(jié)論相一致。北京鴨與吉安紅毛鴨聚為一類，這與張揚(yáng)[12]的結(jié)果相一致。

本研究利用多態(tài)性較好的16 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)中國(guó)地方6 個(gè)鴨品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，所得的聚類圖能夠反映出6 個(gè)鴨品種間的親緣關(guān)系，6個(gè)鴨品種的多態(tài)信息含量高，遺傳多樣性豐富，我們?cè)诤侠黹_發(fā)的同時(shí)更要做好保種工作，保存優(yōu)良的品種資源。