版納微型豬近交系B4GALNT2基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及亞細(xì)胞定位分析

王淑燕，宋 雪，王 配，霍海龍，張 霞，張永云，李羅剛，王雪飛，霍金龍*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/云南省版納微型豬近交系重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院教務(wù)處，昆明 650031；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科專業(yè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，昆明 650201）

豬到人異種器官移植是解決臨床移植供體來源不足的理想途徑，許多學(xué)者認(rèn)為，小型豬體型小且性成熟早，在解剖、生理、代謝和疾病發(fā)生機(jī)理等方面與人極其相似，是理想的異種器官移植供體[1-3]。當(dāng)前科學(xué)家主要通過敲除供體的免疫排斥抗原基因或?qū)胧荏w補(bǔ)體途徑上的關(guān)鍵抗原來改造供體動(dòng)物，從而克服異種器官移植過程中的超急性排斥反應(yīng)（hyperacute rejection，HAR）。血管異種移植物的排斥主要由抗體介導(dǎo)的過程所主導(dǎo)，包括補(bǔ)體介導(dǎo)的損傷和內(nèi)皮細(xì)胞的激活，導(dǎo)致異種移植排斥反應(yīng)，表現(xiàn)為廣泛的微血管血栓形成和凝固性壞死[4]。該過程中除了α-1，3-半乳糖（α-Gal）作為關(guān)鍵的異種移植物排斥抗原[5]，還存在一種潛在的非Gal 免疫原Sda，它是一種血型抗原，跟大部分血型抗原一樣，都是存在于組織和體液中的碳水化合物結(jié)構(gòu)，有助于定義個(gè)體免疫表型[6]。該抗原起初在紅細(xì)胞表面被檢測到的，后來也發(fā)現(xiàn)在其他組織中廣泛分布[7]，因此被命名為“組織血型”抗原[8]。

B4GALNT2 是Sda 抗原合成關(guān)鍵催化酶，它屬于糖基轉(zhuǎn)移家族，被鑒定為GalNAc-轉(zhuǎn)移酶，也稱為β-1，4-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶2，其催化N-乙酰半乳糖胺的末端添加到唾液酸修飾的乳糖胺，以產(chǎn)生GalNAcβ4 [Neu5Acα2，3]Galβ4GlcNAcβ3Gal（Sda 血型抗原）[9]。有研究表明，B4GALNT2 基因在人胚腎293 細(xì)胞（HEK）中表達(dá)會(huì)導(dǎo)致抗體與B4GALNT2 酶的連接增加，當(dāng)豬的心臟移植到靈長類動(dòng)物體內(nèi)后，由于受到靈長類血清的刺激，HEKB4GALNT2 細(xì)胞會(huì)顯示出補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解敏感性增加[10]。G.W.Byrne 等[11-12]使用豬到狒狒心臟異種移植后獲得的血清，研究鑒定了43 種潛在的非Gal靶抗原，包括從豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（PAEC）表達(dá)文庫分離的6 種cDNA，當(dāng)這些cDNA 在HEK 細(xì)胞上表達(dá)時(shí)，各自產(chǎn)生與狒狒非Gal IgG 結(jié)合的豬抗原。這些cDNA 經(jīng)BLAST 搜索，其中一個(gè)被鑒定為與Bos Tauru（牛）β1，4N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶（B4GALNT2）序列同源的豬糖基轉(zhuǎn)移酶[11]。Sda 抗原可作為不同細(xì)胞或微生物的特異性配體或受體[13]，與其生物合成酶β1，4-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶2（B4GALNT2）在各種生理和病理情況下發(fā)揮生物學(xué)作用。B4GALNT2 引起抑制素的非典型糖基化是導(dǎo)致Lacaune 母綿羊高排卵率的主要分子調(diào)控機(jī)制[14]；在小鼠中研究發(fā)現(xiàn)，Sda 抗原可以充當(dāng)宿主和微生物群之間的中間體，敲除B4GALNT2 基因?qū)е履c道微生物群的變化[15]，Sda 還涉及預(yù)防肌營養(yǎng)不良癥的發(fā)生[16-17]；M.D.Montiel 等研究發(fā)現(xiàn)B4GALNT2 基因可能是人結(jié)腸細(xì)胞分化的標(biāo)志物[18]，增加Sda 在人胃腸癌細(xì)胞表面的表達(dá)可抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[19]；Sda還可能介導(dǎo)豬原始胚胎細(xì)胞參與胚胎附著[20]。

版納微型豬近交系（BMI）不僅具有小型豬的特點(diǎn)，而且基因高度純合、遺傳背景清楚，在基因敲除、轉(zhuǎn)基因、異種器官移植等一系列基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。本研究構(gòu)建目的基因（B4GALNT2）和報(bào)告基因（綠色熒光蛋白基因，EGFP）的重組真核表達(dá)載體pEGFP-C1-B4GALNT2，并將其轉(zhuǎn)染豬腎上皮細(xì)胞（PK15），來檢測細(xì)胞中綠色熒光表達(dá)，并用雙熒光染料分別對細(xì)胞核和線粒體進(jìn)行染色，確定BMI B4GALNT2 在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及主要試劑

RT-PCR 方法獲得的B4GALNT2 基因cDNA 序列（組織樣品來自耳號為413、417 和0847 的BMI），豬腎上皮PK15 細(xì)胞、EX Taq 酶、pMD18-T 載體、限制性內(nèi)切酶（Q.CUTEcoR Ⅰ和Q.CUTBamH Ⅰ）、pEGFP-C1 真核表達(dá)載體、Lipofectamine 2000、DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、胰蛋白酶、Mito Tracker 和Hoechst33342 染料。

1.2 設(shè)計(jì)真核表達(dá)引物

根據(jù)BMI B4GALNT2 基因的CDS 序列內(nèi)部限制性酶切位點(diǎn)及pEGFP-C1 綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)的情況，設(shè)計(jì)引物F/R，在CDS上下游引物的5'端分別加入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)（酶切位點(diǎn)序列用下劃線標(biāo)識）。引物如下：

F：GAATTCATGACTTCGTACAGCCCTAG

R：GGATCCTTAGGTGACACATTGGAGAT

1.3 PCR 擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測

以BMI cDNA 為模板，用1.2 中設(shè)計(jì)的真核表達(dá)引物F/R 擴(kuò)增B4GALNT2 真核表達(dá)序列。PCR 擴(kuò)增體系25 μL：ddH2O 5.75 μL，2×GC buffer I 12.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，引物F/R（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 模板（50 ng/μL）1.5 μL，Ex Taq 聚合酶（5 U/μL）0.25 μL。PCR 運(yùn)行條件設(shè)置：預(yù)變性（94 ℃，5 min）；變性（94 ℃，30 s），退火（59 ℃，30 s），延伸（72 ℃，2 min），35 次循環(huán)；后延伸（72 ℃，10 min）。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

1.4 BMI B4GALNT2 基因克隆

目的片段回收純化后與克隆載體pMD18-T 連接，16 ℃過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、復(fù)蘇、培養(yǎng)使其形成單菌落。挑取陽性單菌落，37 ℃200 r/min 振蕩培養(yǎng)，16 h 后以0.2 μL 菌液為模板，進(jìn)行菌液PCR 鑒定。將鑒定為陽性的菌液進(jìn)行序列測定，選取測序結(jié)果無突變的菌液提取pMD18-T-B4GALNT2 重組質(zhì)粒。

1.5 B4GALNT2 基因真核重組表達(dá)載體構(gòu)建

用Q.CUTEcoRⅠ和Q.CUTBamHⅠ同時(shí)雙酶切pMD18-T-B4GALNT2 重組質(zhì)粒與pEGFP-C1 載體，雙酶切體系（50 μL）：重組質(zhì)粒/載體4 μL；10×buffer 5 μL；雙酶各1 μL；水39 μL?；厥漳康幕駼4GALNT2 片段及pEGFP-C1 的大片段并于16 ℃過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a、復(fù)蘇、培養(yǎng)使其形成單菌落。進(jìn)行菌液PCR 鑒定及測序，步驟同1.4。測序結(jié)果無突變的菌液提取pEGFP-C1-B4GALNT2 重組質(zhì)粒。

1.6 PK15 細(xì)胞培養(yǎng)及B4GALNT2 亞細(xì)胞定位

1.6.1 細(xì)胞復(fù)蘇

將凍存于液氮中的PK15 細(xì)胞取出37 ℃迅速解凍，與適量5%細(xì)胞培養(yǎng)液混勻后離心，棄上清，用15%細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔12 h 觀察記錄細(xì)胞生長情況，24 h 更換培養(yǎng)液。

1.6.2 傳代培養(yǎng)

細(xì)胞生長至對數(shù)增長期（即匯合率達(dá)80%～90%）時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液，PBS 沖洗，加入胰酶消化1～3 min，待細(xì)胞呈圓形、游離狀態(tài)時(shí)，終止消化，離心，棄上清，加入10%細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶，完成一次細(xì)胞傳代。

1.6.3 轉(zhuǎn)染、染色及成像

轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞接種至六孔板中，待細(xì)胞達(dá)到30%～40%匯合率時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將BMI pEGFPC1-B4GALNT2 真核表達(dá)重組質(zhì)粒以及pEGFP-C1空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染PK15 細(xì)胞，同時(shí)以未轉(zhuǎn)染的PK15空細(xì)胞作為空白對照，以轉(zhuǎn)染了pEGFP-C1 空載體的PK15 細(xì)胞作為陰性對照。將質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合均勻后，參照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔細(xì)胞中加入500 μL 轉(zhuǎn)染液和1 mL DMEM 培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h 后更換為10%FBS 的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)18～48 h 后檢測綠色熒光，以確定轉(zhuǎn)染成功及正常表達(dá)。先后用Mito Tracker 和Hoechst33342分別對細(xì)胞進(jìn)行染色，倒置熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 B4GALNT2 真核表達(dá)序列擴(kuò)增結(jié)果

引物F/R 擴(kuò)增B4GALNT2 真核表達(dá)序列電泳結(jié)果見圖1，片段大小為1 521 bp，包括完全編碼區(qū)1 509 bp 和兩端添加的EcoRⅠ和BamHⅠ各6 bp的酶切位點(diǎn)。

圖1 BMI B4GALNT2 真核表達(dá)PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果Figure 1 The agarose gel electrophoresis result of eukaryocyte expression PCR products of BMI B4GALNT2

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙限制性內(nèi)切酶對提取的pMD18-T-B4GALNT2 和pEGFP-C1-B4GALNT2質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，電泳條帶分別為2 698/1 521 bp 和4 700/1 521 bp，結(jié)果符合預(yù)期，表明克隆質(zhì)粒pMD18-T-B4GALNT2 和真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-B4GALNT2 構(gòu)建成功，如圖2所示。

圖2 pMD18-T-B4GALNT2（A）和pEGFP-C1-B4GALNT2（B）重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果Figure 2 Identification of the pMD18T-B4GALNT2（A）and pEGFP-C1-B4GALNT2（B）recombinant plasmids

2.3 pEGFP-C1-B4GALNT2 在PK15 細(xì)胞中的表達(dá)與定位

將轉(zhuǎn)染后的PK15 細(xì)胞培養(yǎng)24～48 h 用蔡司倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果能夠檢測到明顯的綠色熒光，證明轉(zhuǎn)染成功。對線粒體和細(xì)胞核進(jìn)行染色后繼續(xù)觀察，藍(lán)色熒光部分代表細(xì)胞核，紅色熒光部分代表細(xì)胞質(zhì)。綠色熒光的位置與紅色熒光重疊，由此確定目的蛋白B4GALNT2 主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)（圖3）。通過PSORTⅡserver（http：//psort.hgc.jp/）對B4GALNT2 蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，預(yù)測結(jié)果44.4%定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，22.2%定位在線粒體，22.2%定位在高爾基體，另有11.1%定位在細(xì)胞質(zhì)。已知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和高爾基體都是位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的細(xì)胞器，因此網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

圖3 pEGFP-C1-B4GALNT2 重組質(zhì)粒在PK15 細(xì)胞中亞細(xì)胞定位Figure 3 Subcellular localization of pEGFP-C1-B4GALNT2 recombinant plasmids in PK15 cell

3 討論與結(jié)論

在靈長類動(dòng)物中預(yù)先形成的對人血清產(chǎn)生細(xì)胞毒性的非Gal 抗體會(huì)引發(fā)早期異種心臟移植損傷，并足以在低濃度下誘導(dǎo)超急性排斥反應(yīng)[21]。J.L.Estrada 等[22]同時(shí)敲除α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（GGTA1）、胞苷單磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶（CMAH）和β-1，4-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶2（B4GALNT2）的基因，克隆出具有3 種抗原缺陷基因的GGTA1/CMAH/B4GALNT2-KO 豬，與只有兩種抗原GGTA1/CMAH 缺陷基因的豬相比，發(fā)現(xiàn)從3 種基因都缺失的豬中分離出的外周血單核細(xì)胞（PBMC）與人IgM/IgG 的結(jié)合明顯減少，且在人和狒狒血清中顯示出了低水平的抗體反應(yīng)性。J.R.Butler 等[23]通過沉默豬B4GALNT2 基因，發(fā)現(xiàn)與人血清中IgG 和IgM 抗體結(jié)合分別減少49.1%和43.2%，而同時(shí)沉默豬中的GGTA1、CMAH 和B4GALNT2 基因可顯著降低豬對人的抗性。因此改變豬的碳水化合物結(jié)構(gòu)可以有效地減少人抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性以及抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)，將有助于異種器官移植臨床的實(shí)現(xiàn)。

B4GALNT2 蛋白具有質(zhì)膜和細(xì)胞質(zhì)兩種不同的細(xì)胞定位，細(xì)胞質(zhì)包括高爾基體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器和其他結(jié)構(gòu)。如果一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶在蛋白質(zhì)或脂質(zhì)的翻譯后修飾中發(fā)揮作用，那么它應(yīng)該位于高爾基體上[24]。將小鼠B4GALNT2-GFP 嵌合體轉(zhuǎn)染囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞，顯示目的蛋白定位在質(zhì)膜上；在懷孕小鼠的子宮組織中，B4GALNT2 蛋白則定位于細(xì)胞質(zhì)而不是質(zhì)膜上[24]?？笲4GALNT2 和凝集素抑制試驗(yàn)證實(shí)B4GALNT2 和Sda 抗原通過小鼠系統(tǒng)和人子宮內(nèi)膜細(xì)胞系在體外和體內(nèi)參與胚胎附著[25]，結(jié)合之前關(guān)于雌性小鼠生殖系統(tǒng)中B4GALNT2 基因調(diào)控的研究[26]進(jìn)一步表明B4GALNT2 和Sda 抗原是胚胎植入所必需的，B4GALNT2 是一種參與胚胎植入的質(zhì)膜蛋白。

在本研究中，我們采用RT-PCR 擴(kuò)增了帶有酶切位點(diǎn)的編碼區(qū)，構(gòu)建了BMI B4GALNT2 與綠色熒光蛋白的融合表達(dá)載體。BMI B4GALNT2 的亞細(xì)胞定位通過在PK15 細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的綠色熒光蛋白融合表達(dá)載體pEGFP-C1-B4GALNT2 來確定。通過非病毒感染的脂質(zhì)體介導(dǎo)法，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒載體pEGFP-C1-B4GALNT2 成功轉(zhuǎn)染PK15 細(xì)胞，以綠色熒光蛋白（EGFP）作為標(biāo)簽蛋白來示蹤B4GALNT2 在PK15 細(xì)胞中的表達(dá)和定位情況。結(jié)合亞細(xì)胞定位的試驗(yàn)結(jié)果和PSORTⅡserver 網(wǎng)站的預(yù)測表明，B4GALNT2 蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，揭示該蛋白在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮其功能作用。綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體的成功構(gòu)建，將為進(jìn)一步探索BMI B4GALNT2 基因在細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

B4GALNT2 基因有一個(gè)十分罕見的特征，它不僅能產(chǎn)生兩個(gè)具有不同轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄本，而且還能產(chǎn)生兩個(gè)具有不同N-末端的蛋白異構(gòu)體[18]。長轉(zhuǎn)錄本編碼的蛋白質(zhì)由66 個(gè)氨基酸殘基組成異常長的胞質(zhì)尾，而短轉(zhuǎn)錄本翻譯的蛋白質(zhì)具有與小鼠序列同源的非常短（6 個(gè)氨基酸殘基）的胞質(zhì)尾[27]。長和短的蛋白異構(gòu)體都具有酶促活性[28]，并且能夠在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中合成Sda 抗原。其中長蛋白異構(gòu)屬于最長的糖基轉(zhuǎn)移酶之一，參與細(xì)胞內(nèi)定位等特定的功能。Sda 抗原序列合成的研究表明，β1，4-GalNA的加入是發(fā)生在加入α2，3-唾液酸之后[29]，所以B4GALNT2 必須（或至少部分）定位在不含α2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的高爾基體中[6]。位于高爾基體中的真核生物糖基轉(zhuǎn)移酶通常由一個(gè)短N(yùn) 末端胞質(zhì)尾部，一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，一個(gè)可變長度的莖區(qū)和一個(gè)大的C 末端球狀催化結(jié)構(gòu)域組成[30]。預(yù)測的B4GALNT2蛋白的一級序列具有與其他糖基轉(zhuǎn)移酶相似的II型跨膜蛋白的特征。

人們普遍認(rèn)為B4GALNT2 是唯一能夠合成Sda抗原的酶，并且該酶是單一遺傳基因座的產(chǎn)物。因此，B4GALNT2 實(shí)現(xiàn)組織特異性酶表達(dá)的最有可能的機(jī)制，是交替使用不同轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的兩個(gè)不同B4GALNT2 基因啟動(dòng)子[5]。未來的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究將有助于闡明由兩個(gè)密集的啟動(dòng)子產(chǎn)生的每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的生物學(xué)意義，這為我們后續(xù)更加深入地探索B4GALNT2 基因的功能提供了研究方向。