葛根芩連湯對感染大腸桿菌小鼠血常規(guī)、血液內毒素及炎性細胞因子含量的影響

王 新，張巍巍，楊 婧，叢 霞，秦志華， 宋學文，張林林，郭 沛，單 虎*

(青島農業(yè)大學動物醫(yī)學院，山東青島 266109)

產腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli, ETEC)是引發(fā)斷奶仔豬腹瀉的重要病原菌之一，黏附性菌毛K88是主要致病因子[1-2]。目前臨床上治療仔豬大腸桿菌性腹瀉是以抗生素為主，但是由于抗生素的不規(guī)范使用導致大腸桿菌多重耐藥、交叉耐藥及藥物殘留的問題日趨嚴重，不僅造成環(huán)境的污染，而且嚴重威脅著人類的身體健康[1]。而中醫(yī)在上千年的發(fā)展進程中產生了大量“對癥下藥、辨證施治、標本兼治”的經(jīng)典方劑，葛根芩連湯就是經(jīng)典方劑之一，其在治療菌痢、腸傷寒等疾患中療效顯著，同時中草藥具有低殘留、不易產生耐藥性等優(yōu)點，受到國內外專家學者的關注[3-4]。本研究探討葛根芩連湯對于感染大腸桿菌小鼠血常規(guī)、血液內毒素及炎性細胞因子含量的影響，旨在為臨床應用葛根芩連湯防治仔豬大腸桿菌性腹瀉提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗試劑 氯化鈉注射液購自貴州天地藥業(yè)有限責任公司，批號H52020070；TNF-α、IL-1β和IL-6酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(48T)均購自南京建成生物工程研究所，批號分別為2018012501、2018012503、2018012509；內毒素檢測鱟試劑盒購自廈門鱟試劑生物科技股份有限公司，批號171018。

1.1.2 試驗藥物 葛根、黃芩、黃連、炙甘草均購自山東省青島市城陽人民醫(yī)院，批號分別為104303、104301、140103、104120；氟苯尼考溶液購自天津市諾維動物藥業(yè)有限公司，批準文號獸藥字(2014)020132111。

1.1.3 試驗菌株 大腸桿菌K88(青島農業(yè)大學動物醫(yī)學院臨床診斷學實驗室惠贈)

1.1.4 試驗動物 SPF級昆明系小鼠，體重18～22 g，購自山東省濟南市朋悅實驗動物繁育有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥液制備 參照《中國人民共和國藥典》中記載的中藥煎煮方法，“先煮葛根、后納諸藥”。稱取所需中藥，用分體式電子智能保健煲煎煮兩次。第一次煎煮加入 8倍量的水將藥材浸泡30 min，加熱煎煮1 h，將藥液經(jīng)四層紗布過濾后裝入1000 mL燒杯中，第二次加4倍量的水，加熱0.5 h，經(jīng)四層紗布過濾后，將兩次煎煮藥液合并，濃縮為1 g/mL 的中藥原液，高壓蒸汽滅菌后放入4 ℃冰箱備用。

1.2.2 葛根芩連湯預防試驗和治療試驗

1.2.2.1 分組及試驗設計 預防試驗：選取健康且體重相近昆明系小鼠80只，隨機分為葛根芩連湯組、氟苯尼考組、模型組、對照組，每組20只，雌雄各半。葛根芩連湯組及氟苯尼考組小鼠攻毒之前連續(xù)給藥5 d，并分別灌服1 mL葛根芩連湯(濃度1 g/mL)、1%的氟苯尼考溶液1 mL，模型組和對照組灌服等量的生理鹽水。葛根芩連湯組、氟苯尼考組和模型組分別于最后一次給藥3 h后腹腔注射0.1 mL大腸桿菌菌液(5×107CFU/mL)，對照組注射等量的生理鹽水。

治療試驗：試驗分組同預防試驗，葛根芩連湯組、氟苯尼考組和模型組分別于第一次給藥前3 h，腹腔注射0.1 mL大腸桿菌K88菌液(5×107CFU/mL)，對照組注射等量的生理鹽水。攻毒3 h后葛根芩連湯組灌服濃度1 mL葛根芩連湯(濃度1 g/mL)，氟苯尼考組灌服1%的氟苯尼考溶液1 mL，模型組、對照組灌服等量的生理鹽水。

1.2.2.2 樣品采集與保存 小鼠攻毒12 h后進行眼眶后靜脈叢采血，將血液采集至肝素鈉抗凝管中用于血常規(guī)檢測，另采集血液至1.5 mL離心管中，室溫放置30 min后3500 rpm/min 離心10 min，收集血清于-20 ℃保存，并保證避免反復凍融。

1.3.1 小鼠死亡率的統(tǒng)計 記錄并統(tǒng)計攻毒后48 h內各組的死亡數(shù)以及死亡率的動態(tài)變化。

1.3.2 血常規(guī)指標檢測 檢測小鼠血液中白細胞、紅細胞、血小板等血常規(guī)指標。

1.3.3 血液中細菌內毒素的含量 參照終點顯色法顯色基質鱟試劑盒說明書進行內毒素的含量測定。

1.3.4 血液中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量 參照酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書，檢測血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件中ANOVA(one way analysis of variance)法，用Duncan法進行均值的多重比較。結果用x±s表示。

2 結果與分析

2.1 小鼠死亡數(shù)和死亡率的動態(tài)變化 根據(jù)表1可知，預防和治療試驗中，模型組與對照組、葛根芩連湯組、氟苯尼考組相比死亡總數(shù)及死亡率均差異極顯著(P<0.01)；預防試驗中，氟苯尼考組死亡率低于葛根芩連湯組，差異不顯著(P>0.05)；治療試驗中，氟苯尼考組死亡率高于葛根芩連湯組，差異不顯著(P>0.05)。

表1 小鼠死亡總數(shù)與死亡率的變化 (n=20)Tab 1 The dynamic changes of death ang mortality in mice (n=20)

與模型組相比，aP<0.05，bP<0.01

Compared with model group,aP<0.05，bP<0.01

2.2 葛根芩連湯對感染大腸桿菌K88小鼠血常規(guī)指標的影響 由表2可知，預防試驗中，模型組的白細胞、中性粒細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞的數(shù)目均極顯著地高于對照組(P<0.01)，淋巴細胞數(shù)目顯著地高于對照組(P<0.05)。葛根芩連湯組和氟苯尼考組白細胞、中性粒細胞、單核細胞數(shù)目均極顯著地高于對照組(P<0.01)，并且極顯著地低于模型組(P<0.01)，嗜酸性粒細胞數(shù)目與對照組相比顯著增高(P<0.05)，同時極顯著低于模型組(P<0.01)。模型組以及葛根芩連湯組的紅細胞數(shù)目、血紅蛋白濃度極顯著地低于對照組(P<0.01)；但葛根芩連湯組紅細胞數(shù)目、血紅蛋白濃度顯著地高于模型組(P<0.05)。氟苯尼考組的紅細胞數(shù)目與對照組沒有差異，血紅蛋白濃度顯著高于對照組(P>0.05)，血小板數(shù)目，與對照組相比極顯著地降低(P<0.01)，而與葛根芩連湯組相比極顯著升高(P<0.01)；氟苯尼考組血小板數(shù)目與模型組沒有差異。

由表3可知，與對照組相比，模型組白細胞、中性粒細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞數(shù)目顯著地增高(P<0.05)，紅細胞數(shù)目、血紅蛋白濃度、血小板數(shù)目極顯著地降低(P<0.01)；葛根芩連湯組的白細胞、中性粒細胞、單核細胞的數(shù)目極顯著高于對照組(P<0.01)，并且極顯著低于模型組(P<0.01)，同時淋巴細胞、嗜酸性粒細胞數(shù)目也均極顯著(P<0.01)低于模型組，以及血紅蛋白濃度、血小板數(shù)目均顯著地低于對照組(P<0.05)，且均顯著高于模型組(P<0.05)；氟苯尼考組中性粒細胞數(shù)目與葛根芩連湯組相比差異極顯著(P<0.01)，并且極顯著高于葛根芩連湯組，血小板數(shù)目與葛根芩連湯組相比差異顯著(P<0.05)，并且顯著低于葛根芩連湯組。

表2 預防試驗小鼠血液中白細胞、紅細胞、血紅蛋白及血小板的數(shù)目(n=20)Tab 2 The content of WBC, RBC, Hb and platelet in blood of mice in prevention group (n=20)

同行數(shù)據(jù)肩標小寫字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，小寫字母不同大寫字母相同表示差異顯著(P<0.05)，大小寫字母均不同表示差異極顯著(P<0.01)

The same row compares, the same lowercase letter means no significant difference (P>0.05), different lowercase letter means significant differences (P<0.05). And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01)

表3 治療試驗小鼠血液中白細胞、紅細胞、血紅蛋白及血小板的數(shù)目Tab 3 The content of WBC, RBC, Hb and platelet in blood of mice in treatment group

同行數(shù)據(jù)肩標小寫字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，小寫字母不同大寫字母相同表示差異顯著(P<0.05)，大小寫字母均不同表示差異極顯著(P<0.01)

The same row compares, the same lowercase letter means no significant difference (P>0.05), different lowercase letter means significant differences (P<0.05). And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01)

2.3 小鼠血液中細菌內毒素的含量變化 由表4可知，預防試驗中，對照組、葛根芩連湯組及氟苯尼考組的內毒素含量極顯著低于模型組(P<0.01)，且葛根芩連湯組極顯著高于對照組(P<0.01)，氟苯尼考組與對照組相比差異不顯著，葛根芩連湯組與氟苯尼考組相比差異不顯著。治療試驗中，對照組和葛根芩連湯組的內毒素含量極顯著低于模型組(P<0.01)，且葛根芩連湯組極顯著高于對照組(P<0.01)；氟苯尼考組的內毒素含量與模型組含量差異顯著(P<0.05)，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，并且極顯著高于對對照組(P<0.01)。

2.4 小鼠血液中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量變化

由表5可知，預防試驗中，模型組TNF-α、IL-1β和IL-6含量均極顯著高于其它三組(P<0.01)；與對照組相比，葛根芩連湯組三種炎性因子的含量均顯著地降低(P<0.05)，氟苯尼考組與對照組無顯著性差異(P>0.05)；氟苯尼考組IL-1β、IL-6顯著高于葛根芩連湯組(P<0.05)，氟苯尼考組TNF-α極顯著高于葛根芩連湯組(P<0.01)。治療試驗中，模型組TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均極顯著地高于其它三組(P<0.01)；葛根芩連湯組、氟苯尼考組TNF-α、IL-1β和IL-6的含量與對照組相比均差異不顯著(P>0.05)；葛根芩連湯組與氟苯尼考組三種炎性因子之間均均差異不顯著(P>0.05)。

表4 各組小鼠血液中細菌內毒素的含量 (EU/mL)Tab 4 The content of bacterial endotoxin in every group(EU/mL)

同列數(shù)據(jù)肩標小寫字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，小寫字母不同大寫字母相同表示差異顯著(P<0.05)，大小寫字母均不同表示差異極顯著(P<0.01)

The same column compares, the same lowercase letter means no significant difference (P>0.05), different lowercase letter means significant differences (P<0.05). And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01)

表5 小鼠血液中炎性因子的含量(ng/L)Tab 5 The content of inflammatory factors(ng/L)

同列數(shù)據(jù)肩標小寫字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，小寫字母不同大寫字母相同表示差異顯著(P<0.05)，大小寫字母均不同表示差異極顯著(P<0.01)

The same column compares, the same lowercase letter means no significant difference (P>0.05), different lowercase letter means significant differences (P<0.05). And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01)

3 討論與結論

3.1 葛根芩連湯對小鼠死亡率的影響 郭莎莎[5]、王華龍[6]研究發(fā)現(xiàn)葛根芩連湯可以有效地治療大腸桿菌性腹瀉，治愈率為98.45%。本試驗中葛根芩連湯表現(xiàn)出了較好的預防和治療大腸桿菌病的作用，并且預防效果接近于氟苯尼考，治療效果優(yōu)于氟苯尼考，結果與以上文獻報道一致。

3.2 葛根芩連湯對小鼠血常規(guī)指標的影響 白細胞分為粒細胞、單核細胞、淋巴細胞三大類，其中粒細胞又可分為中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞。當發(fā)生細菌性感染時白細胞會出現(xiàn)病理性升高，其中以單核細胞、淋巴細胞和中性粒細胞的升高最為明顯，活化的白細胞還能夠分泌產生TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎細胞因子，細胞因子的出現(xiàn)還能夠繼續(xù)趨化、激活白細胞。預防試驗與治療試驗研究發(fā)現(xiàn)，葛根芩連湯組與模型組的各類白細胞數(shù)目均高于對照組，說明大腸桿菌感染小鼠后能夠引起小鼠體內一系列免疫反應。段凱文[7]等報道，黃連黃芩均能夠增強巨噬細胞的吞噬功能。故本試驗在攻毒12 h后檢測血細胞變化，發(fā)現(xiàn)葛根芩連湯組各類白細胞數(shù)目均低于模型組，由此推測葛根芩連湯中的有效成分可通過增強白細胞吞噬能力，在加速白細胞吞噬過程中抑制促炎細胞因子的釋放，使得該中藥方劑產生的一系列保護作用進而減輕小鼠體內的炎癥反應。

試驗研究發(fā)現(xiàn)攻毒后的小鼠紅細胞及血紅蛋白含量均有所降低，但經(jīng)葛根芩連湯治療后，小鼠血液中紅細胞各項水平均有明顯提升。這可能是由于葛根芩連湯通過降低小鼠血液中的內毒素含量，進而提高血液中紅細胞的水平。研究報道，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)能夠抑制紅細胞生成，還能夠激活凝血因子Ⅶ，進而啟動內源性凝血途徑[8,9]。同時，試驗研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠在注射大腸桿菌后血小板明顯減少，葛根芩連湯組的血小板數(shù)目與對照組非常接近，可見葛根芩連湯對于因大腸桿菌感染引起的血小板減少癥有明顯的保護作用。模型組血小板減少可能與血小板過度消耗以及LPS侵入體內引起的彌散性血管內凝血有關[10]。邱艷萍[11]研究證明應用黃連素有抗血小板凝集的作用，并能夠用于防治腦血管中發(fā)生血小板血栓。

3.3 葛根芩連湯對血液中內毒素含量的影響 大腸桿菌K88主要以菌毛、腸毒素和細菌崩解后產生的內毒素發(fā)揮致病作用，進而可導致機體發(fā)生腹瀉[12]。同時，革蘭氏陰性菌細胞壁中的LPS在細菌死亡崩解時大量釋放并且進入循環(huán)血液，造成內毒素血癥[13]。前期已通過預試驗對攻毒小鼠體內介導炎癥反應的受體表達量進行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)攻毒后12 h小鼠體內炎癥反應最強烈，預防試驗與治療試驗中葛根芩連湯組與氟苯尼考組、模型組均檢測出一定濃度的內毒素，但是葛根芩連湯組在預防試驗和治療試驗中其內毒素的含量均極顯著低于模型組(P<0.01)，與章常華[14]等對于葛根芩連湯在代謝性疾病的治療過程中能夠顯著降低小鼠血清中LPS的結論一致。同時，試驗結果驗證了葛根芩連湯通過降低小鼠血液中的內毒素含量，進而提高血液中紅細胞和血小板的水平。

3.4 葛根芩連湯對TNF-α、IL-1 β和IL-6分泌影響 TNF-α、IL-1 β和IL-6都屬于炎癥細胞因子，TNF-α能夠促進IL-1 β和IL-6的分泌，在發(fā)生炎癥和細胞凋亡的過程中具有重要意義[15]。試驗研究發(fā)現(xiàn)葛根芩連湯組小鼠血清中三種因子的含量與對照組相比均有所降低，這與易文[16]、馬建強[17]、趙月蓉[18]等人對相關中藥研究得出的中藥能夠抑制炎癥介質的合成與釋放結論相一致，而氟苯尼考組三種因子含量顯示與對照組沒有差異，由此可初步推測葛根芩連湯防治大腸桿菌病的免疫學機理。

3.5 結論 葛根芩連湯對感染大腸桿菌K88小鼠具有預防和治療的作用。葛根芩連湯主要是通過降低血液中的內毒素及炎性因子的含量，進而降低機體炎癥反應水平，發(fā)揮保護作用。