改良Hodge試驗、CNPt及mCIM篩選肺炎克雷伯菌產(chǎn)碳青霉烯酶的價值

何 紅，黃紫嫣，李 軍，陳立華，沈 暉，鄔靖敏，鄒明祥

(1. 中南大學湘雅醫(yī)院檢驗科，湖南 長沙 410008； 2. 長沙市第一醫(yī)院檢驗科，湖南 長沙 410005)

碳青霉烯類抗生素是治療多重耐藥腸桿菌科細菌，如肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌和腸桿菌屬細菌嚴重感染的關(guān)鍵藥物。然而，隨著該類藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，腸桿菌科細菌，尤其是肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物耐藥率不斷上升，現(xiàn)已達到或超過20%[1-2]。肺炎克雷伯菌毒力強，所致感染臨床癥狀無明顯特異性，一旦對碳青霉烯類耐藥，其引起的感染治療十分困難，病死率極高，已引起全球?qū)W者廣泛關(guān)注。碳青霉烯類抗生素主要包括亞胺培南、美羅培南和厄他培南等。產(chǎn)碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物耐藥最主要的機制[3]，碳青霉烯酶能水解包括碳青霉烯類在內(nèi)的幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗生素。基于分子特征的不同，目前已知的碳青霉烯酶分別屬于Ambler分類法中的A、B及D類。A類和D類為絲氨酸碳青霉烯酶，A類編碼基因以KPC、GES、SHV、TEM和CTX-M等多見，D類以O(shè)XA多見。B類為金屬酶，常見編碼基因為IMP、VIM、GIM和NDM等。部分編碼碳青霉烯酶的基因可通過質(zhì)粒等移動性元件在細菌間水平傳播，目前國內(nèi)外報道較多的有KPC-2、KPC-3、IMP-4、NDM-1和OXA-48等基因亞型，可導致局部流行，甚至感染暴發(fā)。因此，及時、快速、準確地檢測產(chǎn)碳青霉烯酶菌株，對患者的治療和及時采取相應(yīng)的感染控制措施，防止耐藥菌的播散具有十分重要的意義。美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)以流行病學調(diào)查或感染控制為目的，先后推薦改良Hodge試驗(MHT)、Carba NP試驗(CNPt)及改良碳青霉烯酶滅活試驗(mCIM)用于檢測碳青霉烯酶。本研究采用三種方法對臨床分離的117株肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶進行檢測，以探討其臨床應(yīng)用價值，現(xiàn)報告如下。

1 對象與方法

1.1 菌株來源 收集某院2016年12月—2017年11月臨床分離的117株肺炎克雷伯菌，所有菌株均采用VITEK-2全自動微生物分析系統(tǒng)及K-B法進行藥物敏感試驗，其中對碳青霉烯類耐藥57株，敏感60株。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心，ATCC BAA-1705(碳青霉烯酶陽性)和ATCC BAA-1706(碳青霉烯酶陰性)由北京大學臨床藥理研究所李耘教授惠贈。

1.2 主要試劑與儀器 美羅培南藥敏紙片(10 μg)購自英國Oxoid公司，亞胺培南粉劑購自美侖生物，D2000 DNA Marker和引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司，XD-685電解質(zhì)儀購自上海迅達醫(yī)療儀器公司，全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)VITEK 2 Compact及革蘭陰性細菌藥敏卡片購自法國生物梅里埃公司，Technologies ProFlex 梯度PCR購自賽默飛世爾科技，JY600E電泳儀購自北京君意東風電泳設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株復蘇 從冰箱中取出保存菌種恢復至室溫，接種血平板，35℃培養(yǎng)18～20 h。

1.3.2 碳青霉烯酶基因檢測 PCR引物參考相關(guān)文獻[4-5]設(shè)計，序列見表1。擴增碳青霉烯酶基因包括blaKPC、blaNDM-1、blaIMP、blaVIM、blaSIM和blaOXA-48。陽性對照和陰性對照為前期經(jīng)測序證實攜帶或不攜帶碳青霉烯酶基因的臨床菌株。煮沸法提取DNA模板，PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括2×Taq PCR Master Mix 10 μL,上下游引物各

表1碳青霉烯酶基因檢測PCR引物序列及產(chǎn)物長度

Table1PCR primers sequences and product length of carbapenemase gene

引物名稱引物序列(5’→3’)退火溫度(℃)大小(bp)KPCF: ATGTCACTGTATCGCCGTCT53.8893 R:TTTTCAGAGCCTTACTGCCCNDMF:GAATGTCTGGCAGCACACTT57.0480 R:TTGGCCTTGCTGTCCTTGATIMPF: CATGGTTTGGTGGTTCTTG53.9488 R: ATAATTTGGCGGACTTTGGVIMF:GATGGTGTTTGGTCGCAT55.5390 R:CGAATGCGCAGCACCAGSIMF:TACAAGGGATTCGGCATCG57.0571 R:TAATGGCCTGTTCCCATGTGOXA-48F: GCGTGGTTAAGGATGAACAC57.6438 R: CATCAAGTTCAACCCAACCG

1 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 6 μL。PCR擴增反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃，5 min，變性95℃，30 s，退火(具體溫度詳見表1)30 s，延伸72℃，30 s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳(100 V、40 mA)后凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果拍照。陽性擴增產(chǎn)物送華大基因科技股份有限公司測序，序列經(jīng)BLAST數(shù)據(jù)庫進行對比分析。

1.3.3 MHT 具體操作參照2017年CLSI標準進行[6]。挑取大腸埃希菌ATCC 25922(指示菌)于無菌鹽水中配制0.5麥氏單位菌懸液，將菌液1∶10稀釋后，均勻涂布于MH平板上，待吸收完全，中央貼美羅培南藥片。挑取3～5個待測菌株或質(zhì)控菌株，從離美羅培南藥敏紙片5～10 mm處向平板邊緣劃線，長度20～25 mm，35℃過夜培養(yǎng)。結(jié)果判斷：(1)增強性生長,提示產(chǎn)碳青霉烯類酶，結(jié)果陽性；(2)無增強性生長,提示非產(chǎn)碳青霉烯類酶，結(jié)果陰性。

1.3.4 CNPt 具體操作參照2017年CLSI操作標準進行[6]。分別在微量離心管a和管b中加入100 μL pH 7.4 Tris HCl buffer細菌蛋白提取試劑，挑取1 μL接種環(huán)待測菌落或質(zhì)控菌株接種乳化，漩渦震蕩5 s。在管a中加入100 μL pH 7.8的酚紅硫酸鋅溶液，在管b中加入100 μL pH 7.8含6 mg/mL亞胺培南酚紅硫酸鋅溶液，混勻，35℃，孵育2 h，觀察管中液體顏色的變化。結(jié)果判斷：(1)對照管a為紅色或橘紅色，2 h后不變色；(2)管b 2 h后為紅色或橘紅色(不變色)，為陰性；(3)管b 2 h后變?yōu)闇\橘色、深黃色或黃色，為陽性。

1.3.5 mCIM 具體操作參照2017年CLSI操作標準進行[6]。刮取1 μL接種環(huán)待測菌落或質(zhì)控菌株接種至2 mL TSB營養(yǎng)肉湯中乳化，漩渦震蕩10～15 s，再放入美羅培南藥敏紙片，35℃孵育4 h±15 min。配制0.5麥氏單位大腸埃希菌ATCC 25922菌懸液均勻涂布于MH平板上，待吸收，取出孵育后的美羅培南紙片并貼在此MH平板上，35 ℃孵育18～24 h，觀察抑菌圈的大小。結(jié)果判斷：(1)抑菌環(huán)直徑6～15 mm或16～18 mm，但抑菌圈內(nèi)有散在菌落，判為產(chǎn)碳青霉烯酶；(2)抑菌環(huán)直徑≥19 mm，且抑菌圈內(nèi)無散在菌落，判為菌株不產(chǎn)碳青霉烯類酶；(3)抑菌環(huán)直徑16～18 mm或者抑菌環(huán)直徑≥19 mm，但抑菌圈內(nèi)有散在菌落為灰區(qū)。

2 結(jié)果

2.1 碳青霉烯酶耐藥基因檢測 57株耐藥菌株中碳青霉烯酶基因陽性40株，包括39株KPC和1株NDM-1，其余17株菌未檢出blaIMP、blaVIM、blaSIM和blaOXA-48等碳青霉烯酶基因。60株碳青霉烯敏感菌株基因檢測均為陰性。陽性產(chǎn)物測序后，經(jīng)BLAST軟件分析，與目的耐藥基因同源性均≥99%。部分陽性結(jié)果電泳圖見圖1。

M：DNA Marker;1：blaKPC陽性對照; 2：blaKPC陰性對照; 4：blaNDM陽性對照; 5：blaNDM陰性對照; 3、6：待測菌株

圖1碳青霉烯酶基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

Figure1Electrophoresis map of PCR amplification pro-ducts of carbapenemase gene

2.2 MHT檢測結(jié)果 60株碳青霉烯敏感株MHT檢測結(jié)果全部陰性，57株耐藥菌中陽性50株，陽性率87.7%。以耐藥基因擴增為金標準，MHT篩查肺炎克雷伯菌是否產(chǎn)碳青霉烯酶的靈敏度和特異度分別為97.5%(39/40)、85.7%(66/77)，部分菌株結(jié)果見圖2及表2。

ATCC 1705:陽性對照；ATCC 1706:陰性對照； 1、2:待測菌株結(jié)果陽性

圖2部分菌株MHT試驗結(jié)果

Figure2MHT results of partial strains

2.3 CNPt檢測結(jié)果 60株碳青霉烯敏感株CNPt檢測結(jié)果全部陰性，57株耐藥株中51株陽性，陽性率89.5%。以耐藥基因擴增為金標準，CNPt篩查肺炎克雷伯菌是否產(chǎn)碳青霉烯酶的靈敏度和特異度分別為100.0%(40/40)和85.7%(66/77)，部分菌株結(jié)果見圖3及表2。

ATCC 1705:陽性對照；ATCC1706:陰性對照；空白：空白對照管；40:待測菌株結(jié)果陽性

圖3CNPt篩選產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的結(jié)果

Figure3Screening result of carbapenemase-producing strains by CNPt

2.4 mCIM檢測結(jié)果 60株碳青霉烯敏感株mCIM檢測結(jié)果全部陰性，57株耐藥株中52株陽性，陽性率91.2%。mCIM篩查肺炎克雷伯菌是否產(chǎn)碳青霉烯酶的靈敏度和特異度分別為100.0%(40/40)、84.4%(65/77)，部分結(jié)果見圖4及表2。

ATCC 1705:陽性對照；ATCC 1706:陰性對照； 1、2:待測菌株結(jié)果陽性

圖4mCIM篩選產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的結(jié)果

Figure4Screening result of carbapenemase-producing strains by mCIM

3 討論

自2005年后，國內(nèi)外[7-8]相繼報道耐碳青霉烯腸桿科細菌，且耐藥率呈逐年上升趨勢。我國CHINET細菌耐藥監(jiān)測結(jié)果顯示，除克雷伯菌屬外多數(shù)腸桿菌科細菌對碳青霉烯類耐藥率均未超過10.0%，而肺炎克雷伯菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別達20.9%和24.0%，2017年與2005年相比，上升了近8倍[1]。肺炎克雷伯菌對碳青霉烯酶類藥物耐藥已十分嚴重，應(yīng)引起臨床高度重視。由于肺炎克雷伯菌毒力強，引起的感染常較嚴重，一旦對碳青霉烯類耐藥，治療十分棘手。因此，快速、準確檢測肺炎克雷伯菌是否產(chǎn)生碳青霉烯酶具有十分重要的臨床意義和感控價值。

表23種方法篩選肺炎克雷伯菌產(chǎn)碳青霉烯酶的結(jié)果

Table2Results of three methods for screening carbapenemases fromK.pneumoniae

PCRMHT陽性陰性CNPt陽性陰性mCIM陽性陰性合計陽性39140040040陰性11661166126577合計506751665265117

本研究中，39株攜帶KPC基因的菌株，MHT、CNPt及mCIM均為陽性，與報道[9]一致。與基因檢測相比，3種篩選試驗均存在假陽性，假陽性率分別為22.0%、21.6%和23.1%，經(jīng)復核試驗兩次結(jié)果相同。肺炎克雷伯菌的耐藥機制十分復雜，除碳青霉烯酶外，其他β-內(nèi)酰胺酶對碳青霉烯類藥物也可有不同程度的水解能力。同時，基因檢測僅針對目前已知的相關(guān)基因，無法覆蓋所有可能機制，基因檢測可能存在假陰性的情況。5株碳青霉烯耐藥菌株，PCR未檢測到碳青霉烯酶基因，三種檢測結(jié)果也均為陰性，究其原因可能是此5株耐藥菌株為非碳青霉烯酶機制所致，如高產(chǎn)AmpC和(或)ESBLs、膜孔蛋白的改變等。本研究中3種方法的原理均基于碳青霉烯酶對碳青霉烯類抗生素的水解設(shè)計，此5株耐藥菌株結(jié)果為陰性，與文獻[10-11]報道一致。

文獻[4,12]報道，MHT檢測NDM-1型酶菌株時可出現(xiàn)假陰性。本研究中亦發(fā)現(xiàn)1株攜帶NDM-1耐藥基因的菌株(KP10)MHT結(jié)果為陰性，而mCIM和CNPt結(jié)果均為陽性，說明檢測金屬酶該試驗可能會造成漏檢。

研究中碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌CNPt陽性結(jié)果均在15 min內(nèi)出現(xiàn)[9]，而本研究51株CNPt陽性中僅有14株耐藥株15 min內(nèi)出現(xiàn)陽性結(jié)果，其中1株菌不到5 min溶液即變?yōu)樯铧S色，推測CNPt試驗結(jié)果可能與該菌產(chǎn)酶量和酶活性強弱有關(guān)。文獻[13]報道，黏液型菌株CNPt可表現(xiàn)為假陰性。本研究中有3株黏液型肺炎克雷伯菌CNPt 2 h左右僅顯橙色，呈弱陽性，而mCIM均為陽性，可能與黏液型菌株釋放碳青霉烯酶緩慢或產(chǎn)酶量低有關(guān)，說明mCIM對于黏液型肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的篩查能力更強。有研究認為，CNPt可直接檢測預(yù)處理后的血培養(yǎng)陽性標本中產(chǎn)酶株，甚至在肺炎克雷伯菌MIC值未達到耐藥水平時即鑒別是否產(chǎn)酶[14-16]。CNPt檢測周期短，2 h即可判斷結(jié)果。因此，CNPt適用于臨床實驗室小批量檢測產(chǎn)酶株，可為醫(yī)院感染控制快速提供流行病學信息。需要注意的是，CNPt原理是細菌釋放出碳青霉烯酶水解亞胺培南并產(chǎn)酸，pH值下降，酚紅指示劑由橘紅色變?yōu)辄S色或橙色判斷為陽性結(jié)果[17]。因此，反應(yīng)溶液pH值調(diào)節(jié)十分關(guān)鍵。在實驗中發(fā)現(xiàn)，選擇半自動電解質(zhì)儀替代pH精密試紙，將pH值精確調(diào)節(jié)至7.8，結(jié)果顏色變化更加敏感，有利于結(jié)果的觀察。

本研究發(fā)現(xiàn)個別菌株MHT或CNPt試驗結(jié)果難以判斷，但mCIM的陰性和陽性結(jié)果十分明確。同時，mCIM僅使用常規(guī)藥敏紙片，成本低廉，操作簡單，結(jié)果判斷直觀明確，但mCIM需要過夜孵育，時間相對較長，適用于臨床微生物實驗室常規(guī)開展。MHT檢測金屬酶的靈敏度低，假陰性高。隨著產(chǎn)金屬酶菌株的流行，MHT已不宜作為檢測碳青霉烯酶的方法，CLSI 2018年推薦eCIM取代MHT，并聯(lián)合mCIM用于金屬β-內(nèi)酰胺酶的檢測。CNPt結(jié)果快速，但需要特殊配制試劑，操作繁瑣?？梢姡琈HT、CNPt和mCIM三種篩選耐碳青霉酶的方法各有優(yōu)缺點。實驗室可根據(jù)目的及實驗條件不同，選擇最合適的碳青霉烯酶表型檢測方法。