納米硒對鉻中毒肉雞肝臟的保護性研究

羅敏　張輝　張麗鴻　江金歡　張妮婭　周東海

摘要：為探討納米硒對鉻（Cr）中毒肉雞肝臟的保護作用，試驗以120只1日齡肉雞作為模式動物，將肉雞隨機分為6組：空白對照組、Cr（Ⅵ）中毒組、保護組、治療組、預防組和納米硒對照組，通過觀察14、21、28、35日齡肉雞的生長性能、分析肝臟的組織病理學形態(tài)、測量體重變化和臟器指數(shù)，研究納米硒對鉻中毒肉雞肝臟損傷的防治作用及潛在的機制。結(jié)果表明，與Cr（Ⅵ）中毒組相比，納米硒處理組肉雞生長狀況良好，且臟器指數(shù)顯著低于Cr（Ⅵ）中毒組（P<0.05）；納米硒保護組、治療組、預防組肉雞的肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)相較于Cr（Ⅵ）中毒組顯著恢復。因此，納米硒能夠?qū)r（Ⅵ）中毒肉雞肝臟產(chǎn)生保護性作用，這為臨床防治鉻中毒研究及新藥開發(fā)提供了新的思路。

關(guān)鍵詞：肉雞；肝臟；重鉻酸鉀；納米硒；鉻中毒

中圖分類號：S859.8 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2019）04-0005-03

鉻（Cr）是一種在自然界中廣泛存在的重金屬元素，而Cr（Ⅵ）作為一種強氧化劑具有高毒性，多數(shù)被用在工業(yè)生產(chǎn)中。不合理的使用鉻會引起靶器官的肝毒性、氧化應(yīng)激和細胞毒性。Cr（Ⅵ）主要通過消化道、皮膚、呼吸道這三種途徑被機體所吸收[1]。經(jīng)消化道和皮膚攝入少量的Cr（Ⅵ）大多數(shù)均能被還原為Cr（Ⅲ），過量的Cr（Ⅵ）則會引起皮膚過敏、皮炎、潰瘍，胃腸道黏膜糜爛、胃炎、肝炎等癥狀；而經(jīng)呼吸道攝入鉻主要會對暴露于鉻工廠的工人造成嚴重的健康危害，如：鼻中膈潰瘍、鼻黏膜出血、肺炎、呼吸短促等[2]。研究表明，8 μmol/L以上的K2Cr2O7會誘使體外培養(yǎng)的L-02肝細胞DNA產(chǎn)生損傷[3]。考慶君等[4]在給大鼠日糧中添加10%LD50的K2Cr2O7后，其肝臟組織HE切片表現(xiàn)出明顯的肝竇擴張、出血、肝細胞壞死等。王勝男[5]給肉雞喂食K2Cr2O7后，檢測到一些抗氧化酶活性指標如超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）等相比空白組明顯降低。目前的研究證明鉻導致機體毒性的機制主要是：Cr（Ⅵ）進入細胞后，會被抗壞血酸等還原劑還原產(chǎn)生活性氧簇（ROS），同時產(chǎn)生一些中間體導致一系列的毒性效應(yīng)；并且在此過程中產(chǎn)生過量的Cr（Ⅲ）也會造成DNA的損傷。

根據(jù)鉻中毒引起機體氧化損傷的機制，補充抗氧化劑被視為是一種良好的拮抗鉻毒性的方法。研究指出，納米硒具有較高的表面活性、吸收效率、安全性等，能夠提高機體的抗氧化活力、抵抗力、改善胴體品質(zhì)等[6]。當動物機體受到強氧化劑鉻的損傷時，大量的不飽和脂肪酸便會被氧化形成脂質(zhì)過氧化物。胥保華等[7]、胡彩虹等[8]的研究指出，添加0.3～1.0 μmol/L的納米硒到肉雞飼料中能夠使細胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）維持在一個較高的水平，該酶能夠清除機體內(nèi)蓄積的脂質(zhì)過氧化物，從而發(fā)揮其抗氧化防御機制。

由于目前納米硒對鉻中毒肉雞肝臟的防治研究非常有限，且納米硒具有無機硒和有機硒所不具備的高效性、低毒性、生物活性和超高的利用率。因此本試驗以鉻中毒肉雞為研究對象，旨在觀測納米硒對鉻中毒肉雞肝臟損傷的防治作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 120只1日齡AA肉雞（購于武漢市正大公司）。

1.1.2 主要試劑及儀器 重鉻酸鉀（K2Cr2O7，分子質(zhì)量294.19）、納米硒（含量99.99%，200目，平均粒徑40 nm），武漢谷歌生物科技公司；蘇木素伊紅染色試劑盒、10%福爾馬林溶液，武漢博士德生物公司；RM-2245萊卡組織切片機，德國萊卡公司；KD-P攤片機、KD-H烘片機，浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司；OLYMPUS，CX41光學顯微鏡，日本奧林巴斯光學株式會社。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組及給藥方法 將1日齡的AA肉雞120只飼養(yǎng)1周后隨機分為以下6組：空白對照組（C），飼喂基礎(chǔ)日糧和清水；鉻中毒組（Ga），飼喂0.037 g/（kg·d）的K2Cr2O7至第35日齡；保護組（Gb），同時飼喂0.5 mg/（kg·d）的納米硒和0.037 g/（kg·d）的K2Cr2O7至第35日齡；治療組（Gc），飼喂2周0.037 g/（kg·d）的K2Cr2O7后飼喂2周0.5 mg/（kg·d）的納米硒；預防組（Gd），飼喂2周0.5 mg/（kg·d）的納米硒后飼喂2周0.037 g/（kg·d）的K2Cr2O7；納米硒對照組（Ge），在日糧中添加0.5 mg/（kg·d）的納米硒飼喂至第35日齡。自由采食及飲水，室溫控制在34 ℃左右，每周控制溫度下降2～3 ℃直至恒溫，相對濕度為50%～65%。

1.2.2 Cr（VI）中毒肉雞的生長性能檢測 在整個試驗周期中，每天定期觀察并記錄肉雞臨床癥狀變化；按照試驗階段將其分為四個染毒周期（14 d、21 d、28 d、35 d），在每個染毒周期結(jié)束時，記錄肉雞體重情況。

1.2.3 樣本采集及肝臟病理切片觀察 分別于第14、21、28、35天宰殺各組肉雞5只，肝臟稱重，一部分保存于-80 ℃?zhèn)溆?，一部分固定?%的多聚甲醛液中。固定24 h后修整組織形狀，利用乙醇脫水，水楊酸甲酯過夜透明，石蠟包埋，修整蠟塊，切片（厚度5～6 μm），最后H&E染色，OLYMPUS，CX41光學顯微鏡觀察及拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米硒對鉻中毒肉雞生長狀況的影響

研究結(jié)果顯示，空白對照組肉雞生長發(fā)育良好，飲水、采食正常，精神狀態(tài)良好；鉻中毒組肉雞行動遲緩，精神沉郁，食欲、飲欲明顯降低，羽毛干枯不飽滿；與鉻中毒組相比，納米硒對照組、保護組、治療組、預防組肉雞精神較好，體型較大，羽翼豐滿。

2.2 納米硒對鉻中毒肉雞體重變化的影響

由圖1可見，隨著飼喂時間的增長，各組肉雞的體重依次上升；與正常對照組相比，鉻中毒組肉雞體重增加較慢（P<0.05），且各時期體重最低；納米硒對照組肉雞整體上升趨勢最為明顯，且各時期體重最高（P<0.05）；除納米硒對照組，治療組和預防組肉雞體重變化趨勢無明顯組間差異（21 d、28 d、35 d的保護組肉雞除外）。

2.3 納米硒對鉻中毒肉雞肝臟臟器系數(shù)的影響

由圖2可見，與空白對照組相比，在四個不同時期（14 d、21 d、28 d、35 d）鉻中毒組肉雞臟器系數(shù)呈顯著增加趨勢（P<0.05）；各試驗組在第35天時臟器系數(shù)最低；在四個不同時期，納米硒對照組與空白對照組相比其臟器系數(shù)稍高；納米硒保護組、治療組、預防組肉雞臟器系數(shù)在14 d和21 d呈上升趨勢，在28 d和35 d呈下降趨勢，差異性均不顯著（P>0.05）。

2.4 納米硒對鉻中毒肉雞肝臟病理結(jié)構(gòu)的影響

試驗第14、21、28、35天肉雞肝臟的病理結(jié)構(gòu)見圖3（A、B、C、D）所示。由圖3可見，各時期的空白對照組肉雞肝臟結(jié)構(gòu)清晰可辨，細胞核和細胞漿均呈現(xiàn)正常狀態(tài)；納米硒對照組病理切片與空白對照組相比無明顯差異；與空白對照組相比，鉻中毒組肉雞肝細胞索排列紊亂、肝竇間隙充滿紅細胞、肝竇變窄、且細胞膜結(jié)構(gòu)不完整，肝細胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等、數(shù)量不一的圓形空泡，隨著鉻飼喂時期的延長，鉻毒性所致的肝細胞結(jié)構(gòu)損傷更為嚴重；與鉻中毒組相比，不同時期的納米硒保護組、治療組、預防組肉雞肝細胞結(jié)構(gòu)顯著恢復，但肝竇間隙仍存在少量的紅細胞。

3 小結(jié)與討論

近年來，鉻在各行各業(yè)的使用及對環(huán)境造成的污染引起了人們的廣泛關(guān)注，其中Cr（Ⅵ）作為強氧化劑進入機體后會導致肝臟細胞受損，進而使血液中AST、ALT、GGT水平升高；也會導致腎臟的近曲小管和腎小球損傷；上呼吸道黏膜受損出血、誘發(fā)肺水腫和呼吸困難以及使生殖器官的功能、精子活力和數(shù)量下降；DNA鏈斷裂；紅細胞破裂、機體貧血等。目前的研究觀點認為Cr（Ⅵ）誘使機體一系列毒性反應(yīng)的機制是其導致過度的氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量自由基，機體不能及時有效清除蓄積的自由基而處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[9，10]。

中國作為一個養(yǎng)雞大國，其生產(chǎn)的肉雞普遍銷售至國外，然而由于集約化的養(yǎng)殖限制了肉雞的生長，因此如何提高肉雞胴體品質(zhì)及飼料轉(zhuǎn)化率等成為了人們關(guān)注的熱點。大量研究表明，Cr（Ⅲ）因其介導葡萄糖耐量因子（GTF）發(fā)揮胰島素的作用，從而促進機體攝取糖分的能力加強、脂肪水解加強、氨基酸和蛋白質(zhì)合成增加[11-13]。因此越來越多的研究人員在飼料中添加鉻來觀察其對畜禽生長的影響，研究結(jié)果證實飼料中添加適宜劑量Cr（Ⅲ）能夠促進畜禽生長發(fā)育，提高胴體品質(zhì)等。但由于基層養(yǎng)殖人員對Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）的作用機制不明確，導致Cr（Ⅵ）的錯誤添加，這在很大程度上影響了畜禽業(yè)的持續(xù)發(fā)展，同時也導致了嚴重的生物富集現(xiàn)象，進一步危害了人類的健康。

眾所周知的是，一些天然的抗氧化劑如維C、維E、多酚、硒等能夠絡(luò)合重金屬離子來消除其毒性，并且清除自由基而起到保護動物機體的作用[14，15]。納米硒作為一種新型的納米材料，結(jié)合了納米和硒的共同優(yōu)勢，之前主要在大鼠上進行研究，禽類研究較少。本試驗采用納米硒作為抗氧化劑拮抗鉻中毒所致的肉雞肝臟損傷，探討納米硒處理后的鉻中毒肉雞肝臟的一般毒性指標和病理組織學切片變化。

大量的研究表明，衡量動物健康狀況的指標有臟器的顏色、質(zhì)地、光澤度、大小及質(zhì)量等，而本試驗通過對肉雞鉻中毒重要的靶器官肝臟及肉雞體重進行測量分析，試驗數(shù)據(jù)顯示，給健康的肉雞飲水中添加K2Cr2O7后，肉雞體重比同時期空白對照組肉雞體重減輕，提示Cr（Ⅵ）對肉雞的生長發(fā)育存在一定的負面影響，而用納米硒處理Cr（Ⅵ）中毒的肉雞其體重明顯升高，提示納米硒能夠修復鉻中毒所致的機體損傷，且進一步促進肉雞生長。臟器系數(shù)分析結(jié)果表明，鉻處理肉雞后，肉雞肝臟/體重值增加，提示肝臟出現(xiàn)腫大、充血甚至變性，鉻能夠誘使肝臟組織病變；而納米硒的添加能夠降低肉雞肝臟/體重值，但仍高于空白對照組肉雞肝臟/體重值，提示納米硒對鉻所致肉雞肝臟組織的損傷具有保護作用，但并不能完全拮抗鉻對肉雞肝臟的損害作用。

通過對處于四個不同時期的Cr（Ⅵ）暴露肉雞肝臟的組織病理學切片觀察分析，發(fā)現(xiàn)其肝細胞膜結(jié)構(gòu)不完整，且肝細胞核固縮、破裂、溶解，甚至胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡、胞核消失，疑似脂肪變性，隨著攻毒時期的延長，肝竇間隙內(nèi)紅細胞滲出增多、肝細胞結(jié)構(gòu)破壞愈加明顯、且存在明顯的纖維變性；在對Cr（Ⅵ）暴露肉雞進行納米硒處理后，觀察到各納米硒處理組肉雞肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)清晰可辨，出現(xiàn)部分胞核濃染，肝竇間隙的紅細胞數(shù)量減少，肝細胞腫大且胞漿內(nèi)出現(xiàn)淡紅色顆粒，疑似輕微的顆粒變性，提示納米硒對鉻中毒導致的肉雞肝臟損傷具有緩解作用。王洋[16]發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼料中添加鉻后，肉雞肝臟內(nèi)充滿炎性細胞、且肝細胞索排列紊亂、出血嚴重；而在給鉻中毒肉雞飼喂0.63 mg/kg的亞硒酸鈉后，觀察到肝竇間隙出血減少、肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本恢復正常。

綜上所述，納米硒能夠?qū)r（Ⅵ）中毒肉雞肝臟產(chǎn)生保護性作用，這為臨床上鉻中毒的藥物開發(fā)提供了新的思路。

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