褐藻多糖硫酸酯對MPP+損傷的MN9D細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的保護(hù)作用

梁志剛 孫旭文 劉竹麗

[摘要] 目的 探討褐藻多糖硫酸酯（FUC）對帕金森?。≒D）細(xì)胞模型的保護(hù)作用及機(jī)制。 方法 采用100 μmol/L MPP+損傷的MN9D細(xì)胞制作PD模型，用MTS檢測FUC預(yù)處理后PD細(xì)胞模型的細(xì)胞存活率。熒光檢測法測定細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS），熒光素酶法檢測細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的活性變化，Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax及Bcl-2的變化。 結(jié)果 FUC 100 μmol/L作用24 h明顯增加了MPP+損傷的MN9D細(xì)胞存活率，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）;FUC預(yù)保護(hù)明顯降低了MPP+損傷3 h的MN9D細(xì)胞內(nèi)ROS活性及6 h時Caspase-3的表達(dá)，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）;FUC、司來吉蘭預(yù)保護(hù)后MN9D細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)明顯下降，而Bcl-2表達(dá)明顯增加，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 褐藻多糖硫酸酯可能通過抗氧化、降低Caspase-3表達(dá)、抑制細(xì)胞凋亡來保護(hù)PD細(xì)胞模型。

[關(guān)鍵詞] 褐藻多糖硫酸酯;帕金森病;MN9D細(xì)胞;氧化應(yīng)激;細(xì)胞凋亡

[中圖分類號] R742.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（a）-0020-05

[Abstract] Objective To explore the protective effect of fucoidan （FUC） on the cell model of Parkinson′s disease （PD） and its mechanism. Methods PD model was established by MN9D cells which were damaged by 100 μmol/L MPP+. The cell viability of PD cell model was detected by MTS after FUC pretreatment. The reactive oxygen species （ROS） was measured by fluorescence detection， the activity of Caspase-3 in cells was measured by luciferase， the expression changes of apoptosis-related proteins Bax and Bcl-2 were measured by Western blot. Results After application of 12 h， FUC 100 μmol/L significantly increased the cell viability of MN9D cells damaged by MPP+， the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. The FUC pretreatment reduced the activity of intracellular ROS of MN9D cell damaged by MPP+ in 3 h and the expression of Caspase-3 in 6 h， there were highly statistically significant differences （P < 0.01）. After FUC and Selegiline pretreatment， the expression of MN9D cell apoptosis-related protein Bax was decreased， and the expression of Bcl-2 was increased， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Conclusion Fucoidan may protect the PD cell models through anti-oxidation， reducing the expression of Caspase-3 and inhibiting cell apoptosis.

[Key words] Fucoidan; Parkinson′s disease; MN9D cell; Oxidation stress; Cell apoptosis

帕金森?。≒D）是一種常見于中老年的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，目前其確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚。研究認(rèn)為氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡在PD的發(fā)病中起重要作用[1]。褐藻多糖硫酸酯（FUC）是從褐藻中提取的具有抗氧化、抗凝及抗老化作用的多糖。研究表明，F(xiàn)UC具有對阿爾茨海默?。ˋD）模型的神經(jīng)保護(hù)作用[3]，我們推測FUC對于PD亦可能具有一定作用。本研究通過MPP+損傷小鼠中腦多巴胺能細(xì)胞系（MN9D）細(xì)胞制作PD細(xì)胞模型，觀察FUC對細(xì)胞模型氧化應(yīng)激及凋亡的影響，以探討其對PD模型的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

MN9D細(xì)胞（購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，本院中心實(shí)驗(yàn)室保存）;DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Gibco BRL公司產(chǎn)品，11320-033）;新生牛血清（NCS，奧地利PAA公司）;胎牛血清（Gibco公司）;MPP+ idione（美國Sigma公司）;FUC（中國生物檢驗(yàn)中心，純度99.8%，Z20030 053）。陽性對照藥物司來吉蘭（SEL，芬蘭奧立安公司，H20040400）[4]。MTS細(xì)胞活力測定試劑盒（G1112）、Caspase-3活性熒光素酶檢測試劑盒（PROMAGE公司，G8090）;細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）熒光檢測試劑盒（Cell Biolabs公司，K936）;小鼠單克隆Bax（B8249）和Bcl-2（SAB4500003）抗體、GAPDH（G9545）購自Sigma公司。其他試劑均為分析純（購自Sigma公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、PD細(xì)胞模型建立及實(shí)驗(yàn)分組

從液氮罐中取出凍存MN9D細(xì)胞管，迅速放入37°C水浴后，離心半徑13 cm，1000 r/min離心5 min后棄上清，沉淀物用DMEM/F12+10% NCS培養(yǎng)液混懸，吸出細(xì)胞懸液，用適量培養(yǎng)液稀釋后，轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)瓶37°C、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)48 h進(jìn)入指數(shù)生長期后進(jìn)行傳代培養(yǎng)并進(jìn)行試驗(yàn)。將MN9D細(xì)胞接種于Poly-L-lysine包被的96孔板，接種密度為1×105/mL，每孔接種體積為100 μL。細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)24 h后更換含5% NCS的DMEM/F12培養(yǎng)基。不同濃度（0、50、100、200、300、400 μmol/L）的MPP+損傷MN9D細(xì)胞12～48 h后觀察細(xì)胞存活率，篩選出最適濃度（100 μmol/L）MPP+，制備PD細(xì)胞模型;細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h，分別加入不同濃度（1、10、100 μmol/L）的FUC預(yù)保護(hù)1 h后，加入100 μmol/L的MPP+作用24 h，對照組加入相同體積的生理鹽水，MTS法檢測細(xì)胞存活率，篩選出FUC最有效的神經(jīng)保護(hù)濃度。然后將細(xì)胞用簡單隨機(jī)分組法分為對照組、模型組（MPP+ 100 μmol/L）、FUC組（FUC 100 μmol/L+MPP+）、SEL組（SEL 10 μmol/L+MPP+）。各組分別在MPP+作用3 h時觀察ROS的活性，并在6 h時進(jìn)行Caspase-3活性及細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的測定，24 h分別進(jìn)行細(xì)胞活力和形態(tài)學(xué)檢測。

1.3 細(xì)胞存活率及細(xì)胞內(nèi)ROS、Caspase-3的檢測

細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h，分別加入FUC預(yù)保護(hù)1 h后，加入100 μmol/L的MPP+共孵育24 h，對照組僅加入相同體積的生理鹽水，吸取培養(yǎng)液，更換含5% NCS的DMEM/F12培養(yǎng)基，96孔板內(nèi)每孔加入10 μL MTS試劑細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1 h后，加入MTS溶液10 μL/孔，放入CO2孵箱，5%CO2，37℃孵育1～2 h。用酶標(biāo)儀（490 nm波長）測OD值，分別把模型組及不同濃度FUC組OD值/對照組OD值，比值計數(shù)后各組比較。結(jié)果重復(fù)3遍。100 μmol/L FUC預(yù)處理MN9D細(xì)胞1 h，然后加入100 μmol/L MPP+共孵育3 h，1 μg/mL的DCF-DA孵育15 min，倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)ROS情況，并應(yīng)用熒光檢測儀（480 nm波長）檢測ROS的活性，熒光值采用RFU值表達(dá);用100 μmol/L的FUC預(yù)處理MN9D細(xì)胞1 h，然后加入100 μmol/L MPP+共孵育6 h，然后移液器洗去培養(yǎng)液，采用Caspase-Glo Assays（a，b）（Caspase-Glo檢測試劑盒）。加入Caspase-Glo試劑50 μL，隨后加入重組螢光素酶50 μL，然后用Caspase熒光素酶儀器檢測細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的活性，熒光素酶活性單位用RLU值表達(dá)。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

FUC組的FUC預(yù)保護(hù)孵育1 h后，SEL組在10 μmol/L的SEL預(yù)保護(hù)1 h，與模型組同時加入100 μmol/L的MPP+共孵育24 h，對照組加入相同體積的生理鹽水，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，隨機(jī)取4個視野，100×，觀察各組細(xì)胞大少形態(tài)及視野里細(xì)胞數(shù)目。

1.5 細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)

用100 μmol/L FUC預(yù)處理MN9D細(xì)胞1 h，SEL組在10 μmol/L的SEL預(yù)保護(hù)1 h，與模型組同時加入100 μmol/L MPP+共孵育6 h，后提取各組細(xì)胞蛋白，行Western blot檢測Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)，操作方法：向細(xì)胞培養(yǎng)板6孔板中加入蛋白裂解液99 μL、cocktail蛋白酶抑制劑1 μL，冰上裂解5 min，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，移液器把裂解物移到Eppendorf管中，裂解產(chǎn)物超聲處理3次。冰浴中靜置30 min，12 000 r/min，離心半徑6 cm，4℃，離心5 min。將上清移入另一Eppendorf管中，棄去沉，95℃變性5 min，存于-20℃冰箱中待用。灌制10%～12%分離膠和5%積層膠，樣品置于凝膠加樣緩沖液中，電泳槽中充滿電泳緩沖液，加入60 μg樣品后連接電源，80 V，20 min，再換成120 V，80～100 min，電泳后取出凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將凝膠和硝酸纖維素膜裝入標(biāo)有正、負(fù)極的轉(zhuǎn)膜夾板中，置于含有電泳轉(zhuǎn)移緩沖液的轉(zhuǎn)移電泳槽中，100 V，60 min。取出硝酸纖維素濾膜，PBS洗膜10 min，置于含5%脫脂奶粉PBS溶液中封閉，室溫輕搖1～2 h。分別加入含5%脫脂奶粉PBST稀釋的小鼠抗Bax（1∶1000）、Bcl-2（1∶1000），并加入用于作為內(nèi)參的小鼠抗GAPDH抗體（1∶10 000），4℃孵育過夜。次日取出后室溫放置30 min，PBST洗膜3次，每次10 min，加入IRDye800（1∶10 000）標(biāo)記羊抗小鼠二抗，室溫輕搖1 h，PBST洗膜3次，每次10 min，用PBS洗去膜上殘留的Tween-20，隨后用Odyssey紅外成像系統(tǒng)對膜進(jìn)行掃描，并計算各蛋白條帶OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，取4次均值，各實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值進(jìn)行各組之間的比較。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Prism 5.0軟件。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，并繼之以Tukey post-hoc檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MPP+損傷MN9D細(xì)胞存活率的變化及FUC的有效濃度

與對照組（0 μmol/L）比較，50～400 μmol/L MPP+作用12 h以上，MN9D細(xì)胞存活率明顯下降，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。其中100 μmol/L MPP+作用MN9D細(xì)胞24 h，MN9D細(xì)胞存活率下降50%左右。與模型組比較，F(xiàn)UC 10、100 μmol/L作用24 h明顯增加了MPP+損傷的MN9D細(xì)胞存活率，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見圖1。

2.2 實(shí)驗(yàn)各組MN9D細(xì)胞形態(tài)的變化

與對照組（圖2A）比較，模型組細(xì)胞形態(tài)變圓，胞體變小，突起變短或消失（圖2B）;與模型組比較，F(xiàn)UC組細(xì)胞數(shù)目增多，細(xì)胞形態(tài)基本正常，突起基本正常（圖2C），SEL組細(xì)胞形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，細(xì)胞數(shù)目增加（圖2D）。

A：對照組;B：模型組;C：FUC組;D：SEL組。FUC：褐藻多糖硫酸酯;SEL：司來吉蘭

圖2? ?光學(xué)顯微鏡下各組MN9D細(xì)胞形態(tài)（100×）

2.3 各組ROS、Caspase-3、Bax/Bcl-2表達(dá)

2.3.1 各組細(xì)胞內(nèi)ROS、Caspase-3活性的測定? 與對照組比較，模型組ROS熒光明顯增加（P < 0.01）;與模型組比較，F(xiàn)UC組、SEL組ROS熒光強(qiáng)度減少（P < 0.01）。與對照組比較，模型組Caspase-3活力明顯增加（P < 0.01），F(xiàn)UC組、SEL組細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活力較模型組明顯下降，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見圖3。

2.3.2 各組細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的Western blot蛋白表達(dá)條帶及OD值比較? 與對照組比較，模型組Bax表達(dá)明顯增加，Bcl-2表達(dá)明顯下降（P < 0.01），而FUC組、SEL組Bax蛋白表達(dá)較模型組明顯下降，Bcl-2蛋白表達(dá)較模型組明顯增加，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見圖4。

3 討論

PD是第二大神經(jīng)系統(tǒng)變性病[1]，病程進(jìn)展較慢，是遺傳易感性、年齡老化、環(huán)境因素共同作用的結(jié)果[5]，主要病理改變?yōu)槎喟桶纺苌窠?jīng)元壞死，紋狀體內(nèi)多巴胺含量減少，從而出現(xiàn)錐體外系癥狀。目前認(rèn)為氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡在PD 發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[6-7]，因此尋求具有神經(jīng)保護(hù)作用的治療藥物是當(dāng)前PD防治的研究熱點(diǎn)[8]。

多糖是生物體內(nèi)重要的生物大分子，是動植物中的支持組織和重要的能量來源[9]。研究[10]發(fā)現(xiàn)糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）具有在細(xì)胞內(nèi)溶酶體和線粒體水平上對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生早期負(fù)調(diào)控的作用。FUC與GAG結(jié)構(gòu)成分非常類似，為了驗(yàn)證FUC對PD神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，本研究觀察了FUC對MPP+誘導(dǎo)的MN9D細(xì)胞模型保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FUC可有效對抗MPP+造成的MN9D細(xì)胞死亡，并呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。既往研究表明，F(xiàn)UC在體外具有良好的自由基清除能力[11]，本研究結(jié)果支持FUC的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制與抗氧化應(yīng)激有關(guān)。MPP+毒性作用均和氧化應(yīng)激密切相關(guān)[12]，MPP+必須經(jīng)神經(jīng)元細(xì)胞膜上的DAT特異性攝取進(jìn)入細(xì)胞后，通過抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ和氧化應(yīng)激發(fā)揮毒性作用，并能導(dǎo)致多巴胺能細(xì)胞凋亡[13]，根據(jù)我們的前期實(shí)驗(yàn)[14]，選用100 μmol/L MPP+損傷MN9D細(xì)胞作為PD細(xì)胞模型。本研究發(fā)現(xiàn)100 μmol/L FUC可以拮抗MPP+的神經(jīng)毒性，使MN9D細(xì)胞的活力提高近30%，保護(hù)了MPP+損傷的MN9D細(xì)胞形態(tài)，并能減少M(fèi)PP+損傷3 h的MN9D細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，同時降低了MPP+損傷6 h后細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的活性，進(jìn)而降低了MPP+誘導(dǎo)6 h的MN9D細(xì)胞凋亡蛋白Bax的表達(dá)，升高了Bcl-2的表達(dá)，改善了凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2的表達(dá)失衡。提示FUC可能通過降低PD細(xì)胞模型細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，進(jìn)一步減少ROS導(dǎo)致的Caspase級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)MN9D細(xì)胞。

研究表明[15-16]，ROS的產(chǎn)生在PD的發(fā)生中有重要的作用，并是MPP+損傷級聯(lián)效應(yīng)的上游事件。ROS通過促使線粒體釋放細(xì)胞色素C，進(jìn)而激活凋亡通路的信號分子Caspase-9和Caspase-3[17]，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UC可以通過抑制ROS的產(chǎn)生進(jìn)而抑制Caspase-3的激活。促凋亡蛋白Bax與凋亡抑制蛋白Bcl-2在細(xì)胞凋亡中起重要作用[19]，二者的失衡會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡參與了PD的發(fā)生[20]。本研究觀察了FUC對MN9D細(xì)胞模型Bax及Bcl-2表達(dá)的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FUC組及SEL組凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)明顯下降，而Bcl-2表達(dá)明顯增加，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。線粒體膜電位是線粒體損傷的早期標(biāo)記，線粒體損傷是導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS升高的主要原因，并互為因果[21]。本研究中發(fā)現(xiàn)FUC減少了Caspase級聯(lián)反應(yīng)，減少了細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)，增加了Bcl-2的表達(dá)，F(xiàn)UC對細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用及可能機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

本研究在PD細(xì)胞模型上提示FUC能通過降低細(xì)胞內(nèi)ROS及細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的活力，抑制凋亡，減輕MPP+損傷的MN9D細(xì)胞存活率下降及形態(tài)改變，進(jìn)而保護(hù)MN9D細(xì)胞。說明抗氧化劑抗凋亡可能是FUC保護(hù)PD細(xì)胞模型的作用機(jī)制及靶點(diǎn)，進(jìn)一步深入研究會成為PD有效神經(jīng)保護(hù)藥物的研發(fā)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2018-06-11? 本文編輯：張瑜杰）