健脾益氣通絡(luò)中藥對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織病理變化的影響

李瓊鋒 韋袞政 徐蕾 王宮琳

摘要：目的 觀察健脾益氣通絡(luò)中藥對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織病理變化的影響。方法 將實(shí)驗(yàn)用的60只健康雄性SD大鼠，隨機(jī)法分為6組：左腎切除組、模型組、洛汀新組、中藥低、中、高劑量組，每組收入10只，除腎切除組外，其余五組均構(gòu)建糖尿病腎病大鼠模型，并對(duì)中藥低、中、高劑量組進(jìn)行對(duì)應(yīng)劑量的健脾益氣通絡(luò)中藥灌胃，洛汀新組進(jìn)行洛汀新灌胃，對(duì)左腎切除組、模型組進(jìn)行等量生理鹽水灌胃，灌胃6周后，檢測(cè)各組大鼠24h的尿蛋白（Upro）定量、肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）。取腎臟開(kāi)展HE染色行電鏡觀察以及透射電鏡觀察腎皮質(zhì)組織病理改變。結(jié)果 模型組大鼠與腎切組大鼠相比，光鏡及電鏡下已出現(xiàn)糖尿病腎病病理改變，各治療組腎皮質(zhì)病理改變較輕;洛汀新組、中藥低、中、高劑量組與模型組比較，24h尿蛋白（Upro）定量顯著下降（P<0.01）;各治療組與模型組比較，尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）明顯降低（P<0.05）。結(jié)論 健脾益氣通絡(luò)中藥可改善糖尿病腎病大鼠的腎功能，并可減輕腎臟的病理?yè)p害。

關(guān)鍵詞：健脾益氣通絡(luò)中藥;糖尿病腎病;大鼠;病理形態(tài)學(xué)

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2019）01-0063-03

糖尿病腎病（DN）屬于目前世界多發(fā)病和難治病，治療手段有限。現(xiàn)代研究證實(shí)：DN的基本病理改變?yōu)槟I小球萎縮或增大、系膜細(xì)胞肥大和系膜區(qū)擴(kuò)張、腎小球基底膜及腎小管基底膜增厚、腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維化，高濾過(guò)和腎臟肥大等。減輕腎臟病理及腎固有細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損害，改善早期DN病理形態(tài)，延緩病情發(fā)展的方法和藥物，是當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域緊迫解決的重要課題。對(duì)糖尿病腎病進(jìn)行健脾、益氣及通絡(luò)治療，臨床取得較好的效果。本實(shí)驗(yàn)主要研究健脾益氣通絡(luò)中藥復(fù)方應(yīng)用于糖尿病腎病大鼠模型中對(duì)其腎臟病理組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)變化的影響作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取60只健康雄性SD大鼠，均為SPF級(jí)，大鼠體重為200～250 g，購(gòu)自昆明楚商科技有限公司。

1.2 藥物與試劑 鏈脲佐菌素（STZ），（美國(guó) Sigma 公司）。健脾益氣通絡(luò)中藥復(fù)方由黃芪30 g，黨參20 g，茯苓20 g，白術(shù)20 g，丹參20 g，澤蘭20 g，水蛭6 g組成，用免煎中藥配方顆粒（江陰天江藥業(yè)有限公司），由云南中醫(yī)學(xué)院研究實(shí)驗(yàn)中心制備，濃縮至含生藥1 g/mL，分裝滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩Ｎ魉庍x用洛汀新（鹽酸苯那普利片，10mg/片，北京諾華制藥有限公司制造）。Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）。

1.3 主要儀器及設(shè)備 代謝籠（北京翼諾泰科技發(fā)展有限公司）;血糖儀及試紙（德國(guó)羅氏診斷公司）;電子天平（北京賽多利斯電子天平有限公司）;全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)貝克曼公司提供）;超低溫冰箱（日本三洋公司）;電腦（北京六一儀器廠提供）;光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型 60只雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，分別測(cè)定尿蛋白陰性后通過(guò)背部切口行左腎切除術(shù)。2周之后隨機(jī)抽取10只為單純腎切組，剩余大鼠在其腹腔一次性注射鏈脲佐菌素（STZ）40 mg/kg，72 h之后經(jīng)尾靜脈取血檢測(cè)血糖，血糖檢測(cè)值大于或等于16.7 mmol/L，判定為DM造模成功。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法 將造模成功大鼠隨機(jī)分為5組：洛汀新組、模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組。洛汀新組大鼠給予西藥洛汀新0.9 mg（kg·d）灌胃，中藥低、中、高劑量組分別給予免煎中藥配方顆粒5.29 g，10.58 g，21.16 g（kg·d）灌胃，腎切組及模型組分別給予同等生理鹽水灌胃，每日1次，給藥療程共6周。大鼠自由進(jìn)食、飲水，室溫保持在18℃-20℃，相對(duì)濕度，進(jìn)行12 h交替照明。實(shí)驗(yàn)期間每天測(cè)量1次大鼠尾靜脈血糖，對(duì)血糖大于或等于26 mmol/L的大鼠，可能危及生命，給予適量長(zhǎng)效胰島素（1-4 u）皮下注射，避免發(fā)生糖尿病急性并發(fā)癥，減少大鼠死亡。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1 取材 給藥第6周末，將大鼠放入代謝籠內(nèi)，收集24h尿液，記錄總量，檢測(cè)大鼠各組的24 h尿蛋白（Upro）量（由云南中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，所有大鼠均用10%水合氯醛腹腔注射，進(jìn)行麻醉，取腹主動(dòng)脈血，用于檢測(cè)血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）（由云南中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)）。

2.3.2 分離腎臟 取各組大鼠腎皮質(zhì)區(qū)組織，置于4℃預(yù)冷的4%戊二醛電鏡固定液中，制成1 mm3小塊，用玻璃吸管移至標(biāo)本瓶?jī)?nèi)，留做電鏡觀察，其余腎皮質(zhì)部分，置于10%的中性甲醛固定，留做光鏡觀察。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采取統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（SPSS 21.0版本）進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的形式，多重比較使用LSD法進(jìn)行，組間差異采用ANOVA單因素方差分析。P<0.05為數(shù)據(jù)檢測(cè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況 左腎切除組大鼠精神狀態(tài)良好，飲食正常，動(dòng)作敏捷，反應(yīng)靈敏，肌肉豐滿，毛色光澤，尿量正常，沒(méi)用死亡情況。將鏈脲佐菌素注射后，五組大鼠均表現(xiàn)為多飲、多食及多尿，精神萎靡不振，動(dòng)作遲緩，反應(yīng)較為遲鈍，毛枯黃稀少，少動(dòng)抱團(tuán)。治療期間均有大鼠死亡情況，其中中藥中劑量組、洛汀新組各死亡2只，中藥低劑量、高劑量組各死亡3只，模型組死亡4只。

3.2 各組大鼠24h尿蛋白（Pure）定量的比較 與腎切組比較，模型組大鼠24h尿蛋白（Pure）含量顯著升高（P<0.01），各治療組Pure含量均升高（P<0.05）。與模型組比較，使用藥物干預(yù)后各組大鼠的UPro含量均顯著降低（P<0.01）。中藥低、中、高劑量組及洛汀新組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

3.3 各組大鼠腎功能的比較 與腎切組比較，模型組Scr、BUN值均明顯升高（P<0.01），各治療組Scr值無(wú)顯著差異（P>0.05），BUN值升高明顯（P<0.01）;與模型組比較，各治療組Scr值、BUN值均下降（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

3.4 腎臟病理學(xué)

3.4.1 光鏡觀察顯示 單純腎切組大鼠腎組織中的腎小球結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)正常，未見(jiàn)增大及萎縮，腎小球囊腔光滑，無(wú)滲出現(xiàn)象，基底膜無(wú)增厚，系膜細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)分布正常，腎小管結(jié)構(gòu)清晰無(wú)管型;模型組大鼠腎小球萎縮，囊腔增大，系膜細(xì)胞增生，系膜區(qū)增寬。中藥組和洛汀新組病理改變均不同程度地減輕，腎小球仍有萎縮，但囊腔空隙比正常稍大，以中藥中劑量組改善最為明顯。

3.4.2 電鏡觀察顯示 單純腎切組大鼠腎臟足細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，足突排列整齊，分布均勻，無(wú)融合現(xiàn)象，腎小球基底膜均勻無(wú)增厚;模型組大鼠腎臟足細(xì)胞減少，足突增寬，足突融合甚至消失，腎小球基底膜彌漫性增厚。中藥組和洛汀新組病理改變均不同程度地減輕，呈現(xiàn)足突分布均勻，極少出現(xiàn)足突融合現(xiàn)象，基底膜無(wú)明顯增厚，其中中藥高劑量組作用最為明顯。

4 討論

依據(jù)糖尿病腎?。―N）不同的臨床癥狀，DN歸屬中醫(yī)“消渴”、“水腫”、“尿濁”、“虛勞”等病證范疇?，F(xiàn)代醫(yī)家治療DN“多從腎論治”。筆者認(rèn)為脾為后天之本，氣血生化之源，有升清、散精、固攝和的作用。故《素問(wèn)·經(jīng)脈別論》說(shuō)：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺，通條水道，下輸膀胱，水精四布，五經(jīng)并行”。診斷為糖尿病的主要指標(biāo)是血糖升高超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)，而血糖主要來(lái)源于飲食所化之的水谷精微。若脾之健運(yùn)失職，血中之糖（水谷精微），就不能輸布于臟腑而營(yíng)養(yǎng)四肢百骸，水谷精微蓄積而導(dǎo)致血糖升高。胰島素的絕對(duì)或相對(duì)不足，相對(duì)于中醫(yī)為脾氣虛弱，運(yùn)化水谷精微功能不足，脾“為胃行其津液”的物質(zhì)基礎(chǔ)匱乏和功能失調(diào)，故病機(jī)關(guān)鍵在于脾虛[1]。脾虛則固攝無(wú)力，精微物質(zhì)的蛋白質(zhì)流失，出現(xiàn)蛋白尿。脾為氣血生化之源，脾虛氣血生化乏源，氣虛則鼓動(dòng)無(wú)力，血運(yùn)遲緩，血脈瘀阻;血虛則脈絡(luò)欠充盈，血行變緩慢，血液中致病物質(zhì)沉積于脈絡(luò)，脈絡(luò)狹窄，二者均可導(dǎo)致瘀血而成為瘀證。若該病控制不佳，病情發(fā)展波及于腎，隨著腎受損逐漸加重，固攝無(wú)權(quán)，精微物質(zhì)持續(xù)下注，蛋白質(zhì)流失加重，尿蛋白增多。因此，在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，總以“脾傷”、“脾虛”為始動(dòng)環(huán)節(jié)，早期以脾氣虛弱，瘀血阻絡(luò)為基本病機(jī)，日久脾病傳腎。故本實(shí)驗(yàn)采用健脾益氣通絡(luò)中藥復(fù)方來(lái)進(jìn)行干預(yù)，并取得了較好的效果。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)單側(cè)切除腎臟合并小劑量鏈脲佐菌素（STZ），建立的糖尿病腎病大鼠模型，進(jìn)行分組后，各組大鼠連續(xù)給藥6周，檢測(cè)模型組大鼠的SCr，BUN，24h尿蛋白含量均明顯高于單純腎切組（P<0.01），提示此種造模方式可導(dǎo)致大鼠腎損害。而與模型組比較，各治療組可不同程度降低上述各指標(biāo)（P<0.05，P<0.01），表明健脾益氣通絡(luò)中藥可減輕腎臟損傷程度。

形態(tài)學(xué)檢測(cè)是最直觀、最可靠的檢驗(yàn)藥物療效方法，本實(shí)驗(yàn)采用最常規(guī)HE染色，光鏡觀察各組腎組織基本形態(tài)，結(jié)果顯示：模型組大鼠腎組織損傷嚴(yán)重，腎小球出現(xiàn)嚴(yán)重萎縮，囊腔增大，中藥組和洛汀新組病理改變均明顯輕于模型組。足細(xì)胞損傷在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用，足細(xì)胞是高分化細(xì)胞，沒(méi)有再生能力，足細(xì)胞數(shù)量減少所造成的腎小球?yàn)V過(guò)屏障破壞無(wú)法修復(fù)[2-3]，本實(shí)驗(yàn)采用電鏡檢測(cè)足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示：足細(xì)胞數(shù)量減少，足突增寬、融合甚至消失，基底膜彌漫性增厚。與模型組比較，中藥組和洛汀新組病理改變均不同程度減輕上述損傷，高劑量組作用更為明顯。上述各形態(tài)學(xué)結(jié)果表明，健脾益氣通絡(luò)中藥復(fù)方能減輕糖尿病腎病腎臟病理?yè)p害及腎固有細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損害，對(duì)糖尿病腎病具有保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]李瓊鋒，韋袞政，李黔云，等.健脾益氣通絡(luò)方對(duì)早期糖尿病腎病大鼠血清脂聯(lián)素與血清超敏C-反應(yīng)蛋白影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2016，8（8）：78-80.

[2]Jim B，Santos J，Spath F，et al.Biomarkers of diabetic nephropathy，the present and the future[J].Curr Diabetes Rev，2012，8（5）：317-320.

[3]Sun D，Zhao X，Meng L.Relationship between urinary podocytes and kidney diseases[J].Ren Fail，2012，34（3）：403-407.