高效液相色譜法測(cè)定咳喘停袋泡顆粒中黃芩苷的含量

廖汝丹 黃水心

摘要：目的?采用高效液相色譜法測(cè)定咳喘停袋泡顆粒中黃芩苷的含量。方法?用薄層色譜法對(duì)其君藥黃芩中的主要成分黃芩苷進(jìn)行鑒別;以高效液相色譜法對(duì)黃芩苷進(jìn)行定量分析，色譜柱為CAPCELL PAK-C18柱（4.6mmL×250mm，5μm），柱溫30℃，以甲醇-水-磷酸（47：53：0.2）為流動(dòng)相，流速為1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為276nm.結(jié)果?薄層色譜無(wú)干擾，專(zhuān)屬性強(qiáng)。 黃芩苷濃度在0.10048μg/mL～1.0048μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，得回歸方程y=3471.6X-1.8909（r2=1），平均加樣回收率為102.15%，RSD為0.129%（n=6）。 結(jié)論?所用方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于咳喘停袋泡顆粒中黃芩苷的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞：咳喘停袋泡顆粒;黃芩苷;高效液相色譜法;含量測(cè)定

中圖分類(lèi)號(hào)：R927.2?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號(hào)：1007-2349（2019）03-0074-04

咳喘停袋泡顆粒為玉溪市中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，主要成分：金銀花、連翹、黃芩、葶藶子、陳皮、甘草等。功能主治：清熱化痰，肅肺止咳，用于痰熱型急慢性支氣管炎。據(jù)臨床研究表明[1-3]：咳喘停袋泡顆粒廣泛應(yīng)用于臨床，治療慢性支氣管、肺心病急性發(fā)作期、熱哮型支氣管哮喘、特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化等。黃芩為本方的主藥之一，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效，黃芩苷是其主要有效成分。 為了保證服用咳喘停袋泡顆粒的安全性以及有效性，提高院內(nèi)制劑的臨床指導(dǎo)用藥，本文將黃芩苷作為測(cè)定指標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行薄層色譜鑒別，并采用HPLC法對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究。

1?儀器與試藥

儀器：1260型高效液相色譜儀（四元泵帶真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測(cè)器、儀器控制及數(shù)據(jù)處理）;BSA224S-CW電子天平、BP211D-OCE電子天平;cpx5800H-C超聲波清洗儀、PURELAB FLEX超純水儀。

試藥與試劑：黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110715-201720，含量為93.5%）;咳喘停袋泡顆粒（玉溪市中醫(yī)醫(yī)院制劑室）;硅膠GF254薄層板、聚酰胺薄膜（青島海洋化工廠）;甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水。

2?方法選擇與結(jié)果

2.1?定性鑒別[ 10]?取本品粉末 3.5g，加乙酸乙酯-甲醇（3：1）的混合溶液30 mL，加熱回流30 min，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，取上清液作為供試品溶液 。另取黃芩苷對(duì)照品加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置日光燈下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.2?色譜條件?色譜柱：CAPCELL PAK-C18（4.6×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（47：53：0.2）;檢測(cè)波長(zhǎng)：276 nm;理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算不低于5000[8-9]。

2.3?測(cè)定波長(zhǎng)確定?取對(duì)照品溶液，以70%乙醇溶液為空白對(duì)照，在紫外光200 nm～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，黃芩苷對(duì)照品溶液在276 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，且無(wú)干擾。故選擇276 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3?溶液的制備 [10]

3.1?對(duì)照品溶液的制備?（1）取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成0.1 μg/mL的對(duì)照品溶液。（2）取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成50 μg/mL的對(duì)照品溶液。

3.2?供試品的制備?取本品3.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理10 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

3.3?陰性對(duì)照溶液的制備?取缺黃芩的其他組分，按處方工藝制成陰性制劑，按“3.2”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

4?方法學(xué)考察

4.1?專(zhuān)屬性試驗(yàn)?分別精密吸取3.1.1項(xiàng)下的對(duì)照品溶液、3.2項(xiàng)下的供試品溶液、3.3項(xiàng)下的陰性對(duì)照溶液各10μL進(jìn)樣，分別注入液相色譜儀，在2.2色譜條件下，樣品中黃芩苷色譜峰與對(duì)照品黃芩苷色譜峰保留時(shí)間相近，陰性對(duì)照溶液在黃芩苷色譜峰相應(yīng)位置上無(wú)色譜峰出現(xiàn)，證明無(wú)干擾。

4.2?線性范圍考察 精密吸取3.1.2項(xiàng)下制備的黃芩苷對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量分別為2、4、6、8、10、15、20 μL，注入色譜儀，以待測(cè)組分的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸考察。得回歸方程y=3471.6X-1.8909（r=1），結(jié)果表明黃芩苷在0.10048 μg/mL～1.0048 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

4.3?精密度試驗(yàn)?精密取3.1.1項(xiàng)下制備的同一對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果樣品溶液中黃芩苷峰面積的RSD為0.365%，說(shuō)明精密度良好（n=6）。見(jiàn)表1。

4.4?穩(wěn)定性試驗(yàn)?精密吸取同一份供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h分別進(jìn)樣，依照樣品含量測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定峰面積。結(jié)果24 h內(nèi)RSD為 0.06%，說(shuō)明咳喘停袋泡顆粒樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。見(jiàn)表2。

4.5?重復(fù)性試驗(yàn)?取同一批號(hào)的咳喘停袋泡顆粒樣品，精密稱(chēng)取3.5 g，平行制備6份供試品溶液，每份進(jìn)樣3次，測(cè)定峰面積，RSD值為0.320%，表明重現(xiàn)性良好。見(jiàn)表3。

4.6?加樣回收試驗(yàn)?精密稱(chēng)取樣品0.3 g，共6份，按3.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，分別精密加入3.1.2項(xiàng)下制備的濃度相同的黃芩苷對(duì)照品溶液3.27 mL，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)得平均回收率為102.15%，RSD為0.129%。見(jiàn)表4。

5?樣品含量測(cè)定

取3批咳喘停袋泡顆粒，按3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每份進(jìn)樣3次，每次取10 μL注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果得咳喘停袋泡顆粒中黃芩苷的平均含量為5.45 mg/g。見(jiàn)表5。

6?實(shí)驗(yàn)結(jié)果

HPLC法測(cè)定咳喘停袋泡顆粒中黃芩苷含量的方法學(xué)考察結(jié)果表明，在276 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，以甲醇-水-磷酸（47：53：0.2）為流動(dòng)相，C18為固定相，該方法在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，空白無(wú)干擾，可作為咳喘停袋泡顆粒中黃芩苷含量測(cè)定的定量方法，為醫(yī)院制劑提供快速準(zhǔn)確的測(cè)定方法。

7?討論

7.1?供試品提取方法的考察?分別采用以70%甲醇為溶劑進(jìn)行超聲、以及用乙酸乙酯萃取和用甲醇加熱回流對(duì)供試品進(jìn)行提取，結(jié)果用70%甲醇做溶劑峰形良好，分離度好，有效成分含量相對(duì)較高，操作方便。

7.2?定性鑒別?采用不同的展開(kāi)系統(tǒng)以及不同的薄層板對(duì)供試品中的黃芩苷進(jìn)行鑒別，結(jié)果在以聚酰胺薄膜為薄層板，醋酸為展開(kāi)劑，1%三氯化鐵乙醇溶液為顯色劑條件下，斑點(diǎn)顯色清晰，效果相對(duì)較好，其Rf值為0.67。

7.3?測(cè)定波長(zhǎng)的選擇?采用紫外分光光度計(jì)對(duì)黃芩苷對(duì)照品進(jìn)行掃描（400.0 nm-200.0 nm），在276nm處有最大吸收，故采用該波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

7.4?色譜柱的選擇?取同一供試品溶液，采用長(zhǎng)度不同的色譜柱進(jìn)行測(cè)定：150 mm和250 mm，結(jié)果采用長(zhǎng)柱250 mm分離效果較好，峰面積穩(wěn)定，保留時(shí)間相近。

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