廢棄畢赤酵母核糖核酸提取條件的優(yōu)化

卜光明， 顏 茜， 楊海龍*

（1.浙江瑞邦藥業(yè)股份有限公司，浙江 溫州 325000；2.溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035）

核糖核酸（ribonucleicacid，RNA）是生物體內(nèi)的高分子化合物，對(duì)維持機(jī)體的正常功能有重要作用，是特定生理?xiàng)l件下不可缺少的營養(yǎng)成分。外源性核糖核酸在機(jī)體營養(yǎng)、免疫調(diào)節(jié)和疾病防治等方面都有一定的功能，核酸類物質(zhì)可以作為營養(yǎng)保健食品的添加劑，對(duì)促進(jìn)兒童的生長發(fā)育、減緩老年人的衰老和病后虛弱身體的康復(fù)均有一定效果；在農(nóng)牧漁業(yè)中，核酸類物質(zhì)可以用作植物生長刺激劑和飼料添加劑[1-2]。

酵母中RNA含量高，適合于工業(yè)化生產(chǎn)，如利用釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母等微生物發(fā)酵制備[3-4]；同時(shí)，采用啤酒釀造產(chǎn)生的廢棄酵母等原料提取也是獲得RNA的重要途徑[5-6]。甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母（Pichia pastoris）是能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源的酵母菌，作為一類優(yōu)秀的表達(dá)系統(tǒng)，除了具有蛋白質(zhì)的加工和折疊等真核表達(dá)系統(tǒng)所共有的優(yōu)點(diǎn)外，還兼具諸如大腸桿菌等微生物的易于操作的特點(diǎn)；與動(dòng)物細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng)相比，它具有簡(jiǎn)便、快捷、成本低、表達(dá)水平較高等優(yōu)點(diǎn)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于植酸酶、木聚糖酶、白蛋白等產(chǎn)品生產(chǎn)基因工程菌的構(gòu)建[7-10]，并實(shí)現(xiàn)了這些產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)。在生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生大量的畢赤酵母菌體，如不加以處理不僅會(huì)造成資源浪費(fèi)，還會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染[11]。為實(shí)現(xiàn)廢棄資源的綜合利用，本文研究了從廢棄畢赤酵母提取核糖核酸的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

廢棄畢赤酵母：為植酸酶畢赤酵母基因工程菌發(fā)酵副產(chǎn)物，由北京中農(nóng)博特生物工程技術(shù)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 畢赤酵母核糖核酸的提取

提取工藝：取廢畢赤酵母泥→按其干重配成一定濃度的懸浮液100 mL→加入一定濃度的氫氧化鈉調(diào)節(jié)其pH值→在一定溫度下保溫提取一定時(shí)間→離心→棄去殘?jiān)锨逡赫{(diào)節(jié)pH至等電點(diǎn)→過夜沉淀→離心取沉淀→核糖核酸→干燥后稱重。

1.2.2 畢赤酵母核糖核酸含量的測(cè)定[6]

采用紫外分光光度法測(cè)定，取一定量的RNA樣品，用水定容至100 mL，經(jīng)適當(dāng)稀釋后分別測(cè)定吸光值A(chǔ)260和A280，并計(jì)算A260/A280判斷所提取核糖核酸樣品的純度。由以下公式計(jì)算核糖核酸的提取率：

式中：A260為樣品波長260 nm處的吸光度值；100為樣品定容的體積；N為稀釋倍數(shù)；m為稱取的 RNA樣品重量 （g）；106為 μg轉(zhuǎn)換為 g；0.024 為 1 μg/mL RNA 的 A260。

1.2.3 畢赤酵母核糖核酸提取條件優(yōu)化的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

影響畢赤酵母核糖核酸提取的因素有很多，本文利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究溶液pH值、提取溫度、提取時(shí)間、畢赤酵母濃度對(duì)核糖核酸提取的影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)四因素三個(gè)水平正交試驗(yàn)，如表1。

表1 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors table of orthogonal test

2 結(jié)果與討論

2.1 pH值對(duì)核糖核酸提取的影響

配置10%濃度的畢赤酵母溶液100 mL，分別調(diào) pH 至 7、8、9、10、11， 于 85 ℃下抽提 1.5 h，離心取上清液，調(diào)至核酸等電點(diǎn)（pH=2.5），過夜沉淀得到RNA，結(jié)果見圖1。由圖1可知，核糖核酸的提取率隨pH值的增大而增大，pH為9時(shí)提取率達(dá)到1.74%。而在啤酒酵母的提取中，pH=7.5時(shí)，核糖核酸的提取率和純度達(dá)到最大[12]，且隨著pH值的增大，提取率逐漸減少。啤酒酵母和畢赤酵母的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)成分上存在一定的差異，pH較大的情況下對(duì)畢赤酵母細(xì)胞壁的作用更好，使其具有較好的通透性。因此，可以選擇pH=9進(jìn)行下面的試驗(yàn)。

圖1 pH值對(duì)RNA提取率的影響Fig.1 The effects of pH on the extraction of RNA

2.2 提取溫度對(duì)堿法核酸提取的影響

配置10%濃度的畢赤酵母溶液100 mL，調(diào)pH至9，分別置于55℃、65℃、75℃、85℃、95℃下抽提1.5 h，離心取上清液，調(diào)至核酸等電點(diǎn)，過夜沉淀獲得RNA，結(jié)果見圖2。由圖2可知，溫度越高，促進(jìn)了堿對(duì)畢赤酵母細(xì)胞壁的作用，使核糖核酸釋放得越多，核糖核酸的提取量隨溫度的升高而增大，溫度95℃時(shí)提取量達(dá)到1.85%。

圖2 提取溫度對(duì)RNA提取率的影響Fig.2 The effects of temperature on the extraction of RNA

2.3 提取時(shí)間對(duì)堿法核酸提取的影響

配置10%濃度的畢赤酵母溶液100 mL，調(diào)pH 至9置于 95℃下，分別提取 0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，離心取上清液，調(diào)至核酸等電點(diǎn)，過夜沉淀獲得RNA，結(jié)果見圖3。由圖3可知，在0.5～2.5 h內(nèi)，核糖核酸的提取量隨時(shí)間的加長而增大，2.5 h后核糖核酸提取量不再增加，而且隨著時(shí)間的加長，核糖核酸在堿性條件下會(huì)有一部分水解成核苷酸而導(dǎo)致提取率降低[13]，故核糖核酸提取的最佳抽提時(shí)間為2.5 h，核糖核酸提取率達(dá)到1.92%。

圖3 提取時(shí)間對(duì)RNA提取率的影響Fig.3 The effects of reaction time on the extraction of RNA

2.4 酵母濃度對(duì)堿法核酸提取的影響

分別配置濃度為3%、6%、9%、12%、15%的畢赤酵母溶液各100 mL，調(diào)pH至 9，于95℃下抽提1.5 h，離心取上清液，調(diào)至核糖核酸等電點(diǎn)，過夜沉淀獲得RNA，結(jié)果見圖4。由圖4可知，畢赤酵母濃度為6%時(shí)，核糖核酸的提取率最大（2.89%），進(jìn)一步提高畢赤酵母的濃度，固液比增大，在特定時(shí)間內(nèi)堿性溶液與畢赤酵母作用強(qiáng)度有限，影響了核糖核酸的釋放，導(dǎo)致提取率的降低。

2.5 提取工藝的優(yōu)化

根據(jù)表1的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到正交試驗(yàn)的結(jié)果見表2。由極差分析可知，對(duì)堿法提取畢赤酵母核糖核酸含量的影響因素依次為：抽提溫度＞溶液pH＞酵母濃度＞抽提時(shí)間。抽提時(shí)間的影響作用最小，但如果抽提時(shí)間過長，雜質(zhì)會(huì)相應(yīng)地增多。根據(jù)以上分析結(jié)果，確定在本實(shí)驗(yàn)所選因素條件下，以酵母濃度3%，pH=10，抽提溫度為100℃，抽提時(shí)間為2.5 h時(shí)，核糖核酸提取率最高。

圖4 酵母濃度對(duì)RNA提取率的影響Fig.4 The effects of P.pastorisconcentration on the extraction of RNA

表2 正交試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果（L9（34））Table 2 Orthogonal experimental design and results

2.6 優(yōu)化條件的驗(yàn)證

以正交實(shí)驗(yàn)分析法選出的最適宜提取畢赤酵母核糖核酸的條件進(jìn)行5組實(shí)驗(yàn)，得到的核糖核酸提取率分別為 3.05%、2.98%、3.24%、3.13%、3.16%，平均提取率為3.11%

3 小結(jié)

本文研究了堿法提取畢赤酵母核糖核酸的工藝條件，單因素試驗(yàn)結(jié)果表明畢赤酵母核糖核酸提取的條件為：pH=9、時(shí)間 為2.5 h、溫度為95℃、酵母濃度為6%。經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化確定畢赤酵母核糖核酸提取的最佳工藝條件為：pH=10，提提溫度為100℃，時(shí)間為2.5 h，酵母濃度為3%，最佳工藝條件下，核糖核酸的提取率可達(dá)3.11%。目前，以畢赤酵母為表達(dá)系統(tǒng)開發(fā)的基因工程均采用高密度發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)，產(chǎn)生大量的酵母菌體，從廢棄畢赤酵母泥中提取核糖核酸，是實(shí)現(xiàn)廢棄畢赤酵母綜合利用的有效途徑。