重瓣榆葉梅莖段組織培養(yǎng)體系的建立

張赫巖，葉冬梅，白玉娥，段國(guó)珍，彭 鵬，華佳文

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019）

重瓣榆葉梅Amygdalus trilobaf.multiplex，是薔薇科Rosaceae 桃屬Amygdalus的一種花灌木植物，具有開花早、花期長(zhǎng)、花朵大、顏色鮮艷純正等特點(diǎn)，是一種觀賞價(jià)值很高的園林綠化樹種[1]。其株高2 ～5 m，枝條開展，具多數(shù)短小枝；短枝上的葉常簇生，一年生枝上的葉互生；嫩枝上無(wú)毛或微有被毛；葉片呈寬卵形或倒卵形。重瓣榆葉梅開花早，花重瓣且較大，花期長(zhǎng)，花色粉紅，花型美麗，是北方地區(qū)早春觀賞價(jià)值極高的園林綠化樹種。重瓣榆葉梅的花枝細(xì)長(zhǎng)，花型美麗，可以做插花供應(yīng)材料，且現(xiàn)在擁有一定的市場(chǎng)；花粉營(yíng)養(yǎng)成分豐富，含有蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、維生素、微量元素、生物酶、黃酮類等化合物，可用于保健食品、藥品以及營(yíng)養(yǎng)性化妝品[1]。因此，重瓣榆葉梅是一種應(yīng)用廣泛、具有一定經(jīng)濟(jì)價(jià)值的園林綠化樹種。

目前，重瓣榆葉梅在園林綠化中備受青睞，但因雌雄蕊退化，不能正常結(jié)實(shí)獲得種子，很難滿足生產(chǎn)需求[2]。榆葉梅的繁殖方法較多，如播種、扦插、分株、嫁接和組織培養(yǎng)繁殖等[3-4]。但常規(guī)扦插受到各種條件限制，成活率低；分株與嫁接繁殖系數(shù)低，速度慢，致使規(guī)模繁殖受限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需求[5]。組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖速度快、繁殖系數(shù)大的優(yōu)點(diǎn)，不受繁殖材料和季節(jié)的限制，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量無(wú)性系[6-7]。冷肖荀等人[8]選擇重瓣榆葉梅的莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)，結(jié)果表明6-BA 1.0 mg/L 對(duì)榆葉梅的嫩芽分化效果顯著。宋潤(rùn)剛等人[5]在研究重瓣榆葉梅組織培養(yǎng)過程中，以莖尖為外植體，在培養(yǎng)過程中可以使用抗生素類物質(zhì)控制雜菌污染，并且可以提高芽的增殖和分化能力。不同部位外植體的取材對(duì)重瓣榆葉梅的組織培養(yǎng)影響較大，李鳳飛[3]進(jìn)行啟動(dòng)培養(yǎng)時(shí)，選擇頂芽、腋芽、莖段3 種不同部位作為外植體，其中莖段的出芽率最高。但是在榆葉梅組織培養(yǎng)過程中，多數(shù)研究均存在接種外植體的褐化、接種萌芽率低等問題。因此，為解決重瓣榆葉梅繁殖系數(shù)低、接種萌芽率低和保持品種的優(yōu)良特性，本試驗(yàn)采用組織培養(yǎng)對(duì)重瓣榆葉梅進(jìn)行無(wú)性繁殖，以重瓣榆葉梅帶腋芽的莖段作為試驗(yàn)材料，研究不同消毒方式、不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)重瓣榆葉梅誘導(dǎo)、增殖、生根的影響，以期為重瓣榆葉梅的快速繁殖提供參考依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用材料均采集于呼和浩特樹木園內(nèi)，采集時(shí)間為1—4月。樹齡為3 ～5年生的重瓣榆葉梅當(dāng)年生枝條或一年生枝條，剪去葉片及葉柄，截取帶有一個(gè)腋芽的莖段作為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒

將試驗(yàn)材料的葉片及葉柄全部剪去，使用洗潔精對(duì)帶有腋芽的莖段進(jìn)行清洗，重點(diǎn)刷洗重瓣榆葉梅的腋芽部位。將刷洗好的莖段裝進(jìn)燒杯，流水沖洗30 min。于超凈工作臺(tái)中用75%酒精處理30 s，無(wú)菌水沖洗3 次，然后分別以0.1%升汞溶液（處理6、8、10、12、14 min）、2%次氯酸鈉溶液（處理6、8、10、12、14 min）進(jìn)行消毒，最后使用無(wú)菌水沖洗5 次。接種于以MS 為基本培養(yǎng)基、添加IBA 0.5 mg/L 的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃，光照強(qiáng)度2 000 lx ，光照14 h/d，pH值5.8 ～5.9。接種后5 d 開始統(tǒng)計(jì)外植體感染及存活情況。

1.2.2 初代培養(yǎng)

在無(wú)菌濾紙上將消毒好的莖段切去與消毒液接觸的兩端，再將莖段切成帶有一個(gè)腋芽的小段，接種于分別以MS、WPM 為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L、瓊脂6 g/L，不同質(zhì)量濃度的6-BA（1.0 ～2.0 mg/L）、NAA（0.05 ～0.20 mg/L）的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照14 h/d，pH 值5.8 ～5.9。接種后30 d 觀察并統(tǒng)計(jì)叢生芽的生長(zhǎng)情況。

1.2.3 繼代增殖

以初代培養(yǎng)的重瓣榆葉梅叢生芽為外植體進(jìn)行增殖，以MS 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L、瓊脂6 g/L 以及不同質(zhì)量濃度的6-BA（1.0 ～2.0 mg/L）、NAA（0.1 ～0.5 mg/L）、KT（0 ～1.0 mg/L）。培養(yǎng)條件與初代培養(yǎng)一致，30 d 后統(tǒng)計(jì)幼苗的增殖情況及生長(zhǎng)狀況。

1.2.4 生根培養(yǎng)

以增殖培養(yǎng)得到的無(wú)菌苗為材料進(jìn)行生根培養(yǎng)，在1/2MS 培養(yǎng)基中，添加蔗糖20 g/L、瓊脂5.5 g/L，附加不同質(zhì)量濃度的NAA（0.1 ～0.3 mg/L）和IBA（0.1 ～0.3 mg/L）。培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，光照強(qiáng)度2 000 lx ，光照14 h/d，pH值5.7 ～5.8。20 d 后統(tǒng)計(jì)幼苗的生根和生長(zhǎng)狀況。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用Excel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，SPSS 19.0 軟件進(jìn)行結(jié)果分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法對(duì)重瓣榆葉梅莖段消毒的影響

不同消毒方法對(duì)重瓣榆葉梅莖段消毒的影響見表1。

表1 不同消毒方法和時(shí)間對(duì)莖段外植體滅菌的影響?Table1 Effects of different disinfection ways and time on sterilization of stem segment explants

試驗(yàn)結(jié)果表明，0.1%升汞和2%次氯酸鈉都具有一定的莖段表面滅菌效果，在一定范圍內(nèi)感染率會(huì)隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而降低，存活率隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而降低。因此在篩選最佳消毒時(shí)間時(shí)，可以綜合這兩種消毒方法考慮。使用0.1%升汞對(duì)莖段進(jìn)行消毒8 min 時(shí)，感染率較低，為13.30%，存活率較高，為76.7%；在14 min 時(shí)雖然感染率已經(jīng)為零，但存活率較低，說明消毒時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)將植物細(xì)胞殺死，影響莖段生長(zhǎng)，所以在使用0.1%升汞進(jìn)行消毒時(shí)，8 min 為最佳消毒時(shí)間，效果最好。同理，使用2%次氯酸鈉消毒12 min 時(shí)，感染率較低，存活率較高，所以在使用2%次氯酸鈉進(jìn)行消毒時(shí)，12 min 為最佳消毒時(shí)間。重瓣榆葉梅莖段的最佳消毒方案為：75%酒精處理30 s，然后使用0.1%升汞處理8 min 或使用2%次氯酸鈉處理12 min。圖1和圖2分別為莖段初代培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況。

2.2 不同激素種類與質(zhì)量濃度配比對(duì)誘導(dǎo)芽萌發(fā)的影響

重瓣榆葉梅莖段接種后，放至培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，定期觀察側(cè)芽生長(zhǎng)狀況，40 d 后統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)情況。

在比較MS 培養(yǎng)基和WPM 培養(yǎng)基對(duì)莖段啟動(dòng)培養(yǎng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，從啟動(dòng)率、生長(zhǎng)狀況兩方面觀察，同種質(zhì)量濃度下使用MS 培養(yǎng)基比WPM 培養(yǎng)基誘導(dǎo)率高，生長(zhǎng)狀況好，所以重瓣榆葉梅莖段啟動(dòng)培養(yǎng)的最適基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基（表2）。對(duì)照組C7 的莖段誘導(dǎo)率低于其他處理，說明添加適宜的外源激素對(duì)莖段啟動(dòng)培養(yǎng)有一定作用；當(dāng)添加6-BA 2.0 mg/L+0.05 mg/L NAA 時(shí)，誘導(dǎo)率最高，達(dá)89.30%，且生長(zhǎng)狀況良好，利于繼代增殖。因此，對(duì)于重瓣榆葉梅莖段誘導(dǎo)芽萌發(fā)的啟動(dòng)培養(yǎng)，最適培養(yǎng)基為MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L。

圖1 莖段初代培養(yǎng)生長(zhǎng)良好Fig.1 Stem segments growing well in initial culture

圖2 莖段初代培養(yǎng)生長(zhǎng)較差Fig.2 Stem segments growing poorer in initial culture

表2 不同激素配比對(duì)莖段芽誘導(dǎo)的影響?Table2 Effects of different hormone combinations on induction of axillary bud stem segments

2.3 繼代增殖培養(yǎng)

如表3所示，不同激素質(zhì)量濃度配比對(duì)重瓣榆葉梅增殖培養(yǎng)效果不同。添加 KT 1.0 mg/L，其增殖率升高，叢生芽長(zhǎng)勢(shì)更健康，葉片呈翠綠色。平均株高以及增殖率情況比較好的處理是E1、E2、E7、E8，說明低質(zhì)量濃度的NAA 可以促進(jìn)叢生芽增殖及生長(zhǎng)，質(zhì)量濃度過高會(huì)對(duì)組培苗產(chǎn)生抑制作用（圖3、圖4）。綜合平均株高與增殖率來看，在增殖階段最適增殖培養(yǎng)基為MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L+ KT 1.0 mg/L。

表3 不同激素配比對(duì)叢生芽增殖的影響?Table3 Effects of different hormone combinations on proliferation of axillary bud

圖3 增殖培養(yǎng)生長(zhǎng)狀況較好Fig.3 Proliferation culture growing well

2.4 誘導(dǎo)生根

將增殖培養(yǎng)得到的幼苗接種在1/2MS 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)根系，結(jié)果如表4所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，添加適宜的激素可以促進(jìn)組培苗生根，生根率隨著IBA 和NAA 質(zhì)量濃度的增加而增加，但到達(dá)一定程度后生根率會(huì)隨著激素質(zhì)量濃度增加而減小。經(jīng)過30 d 的培養(yǎng)，生根數(shù)目為1 ～4 條，根長(zhǎng)為2 ～5 cm（圖5）。綜合平均根數(shù)、平均根長(zhǎng)、生根率3 個(gè)指標(biāo)來看，誘導(dǎo)生根最佳處理是F2，即1/2MS + IBA 0.2 mg/L。

圖4 增殖培養(yǎng)生長(zhǎng)狀況較差Fig.4 Proliferation culture growing poor

3 討 論

外植體消毒是植物組織培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)之一，獲得無(wú)菌且具有生長(zhǎng)活性的外植體是組織培養(yǎng)取得成功的重要因素[9]。在試驗(yàn)過程中使外植體不經(jīng)愈傷組織脫分化培養(yǎng)階段，而直接誘導(dǎo)分化苗，省去了誘導(dǎo)愈傷組織這一步，簡(jiǎn)化了技術(shù)程序，縮短了培養(yǎng)時(shí)間，同時(shí)經(jīng)這種途徑培育出的苗木能穩(wěn)定地保持母體的優(yōu)良遺傳特性[10]。通過對(duì)外植體的消毒，殺死外植體表面微生物，但是要保證盡可能減少外植體表面細(xì)胞的傷害，它的成功與否直接影響后續(xù)環(huán)節(jié)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，外植體的選擇對(duì)重瓣榆葉梅的污染率以及死亡率有一定影響，莖段較嫩在消毒時(shí)容易死亡，且腋芽生長(zhǎng)緩慢矮??；選取半木質(zhì)化的莖段，死亡率降低，且腋芽生長(zhǎng)狀況良好，易于后期繼代增殖，這與吳玲利等[9]在白木通Akebia trifoliatavar.australis組織培養(yǎng)及快速繁殖的研究相一致。因此在采集外植體時(shí)最好不要選擇當(dāng)年生幼枝，選取半木質(zhì)化的莖段進(jìn)行組織培養(yǎng)較好。

表4 不同處理對(duì)生根培養(yǎng)的影響?Table4 Effects of different treatments on rooting culture percentage

圖5 芽在生根培養(yǎng)基中生長(zhǎng)Fig.5 Buds growing in the rooting medium

激素的種類與質(zhì)量濃度對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起著至為關(guān)鍵的作用[12]。在進(jìn)行重瓣榆葉梅組織培養(yǎng)時(shí)，高質(zhì)量濃度的激素可促進(jìn)組培苗的增殖，但抑制了生長(zhǎng)。當(dāng)NAA 質(zhì)量濃度較高時(shí)，重瓣榆葉梅的生長(zhǎng)狀況較差，植株矮小且葉片小，反而較低質(zhì)量濃度的NAA 會(huì)促進(jìn)叢生芽增殖，長(zhǎng)出的新芽體積變大。KT 的有無(wú)對(duì)叢生芽增殖有很好的促進(jìn)作用，添加了KT，叢生芽明顯比沒有加KT 的叢生芽增殖得多，體積更大。低質(zhì)量濃度的6-BA 促進(jìn)重瓣榆葉梅繼代增殖，這與冼康華等[13]對(duì)文采唇柱苣苔Chirita wentsaiiD.Fang et L.Zeng的研究結(jié)果相似。

在生根培養(yǎng)時(shí)，芽基部生長(zhǎng)出大小不均的顆粒狀愈傷組織，在此基礎(chǔ)上生長(zhǎng)出根，屬于愈傷型生根。重瓣榆葉梅適宜在生長(zhǎng)素質(zhì)量濃度較低的條件生根，當(dāng)IBA 或NAA 質(zhì)量濃度超過0.2 mg/L時(shí)會(huì)抑制生根。

使用IBA 誘導(dǎo)生根的效果比NAA 更好，生根數(shù)目多，根系長(zhǎng)，生根率高，這與孟永紅等[14]在楸樹Catalpa bungei植株再生體系研究中的結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行重瓣榆葉梅莖段組織培養(yǎng)時(shí)，外植體消毒先用75% 酒精處理30 s，然后用0.1% 升汞溶液消毒8 min 或2% 次氯酸鈉溶液消毒12 min，效果最好，莖段感染率較低，存活率高；在選擇初代培養(yǎng)基時(shí)，以MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L 為基本培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率可達(dá)89.30%；增殖培養(yǎng)基以MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L + KT 1.0 mg/L 為最佳，增殖倍數(shù)為4.4，且生長(zhǎng)狀況良好；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS + IBA 0.2 mg/L。