電針對(duì)慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠腦組織內(nèi)大麻素水解酶的影響*

劉 娟，田 磊，趙 楊，陸 健，雷正權(quán)，杜 旭，劉繼平

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽(yáng) 712046)； 2.陜西省寶雞市中醫(yī)醫(yī)院(寶雞721000)

抑郁癥(Depression)主要是以顯著且持續(xù)性的心情低落與興趣及歡愉感缺失為主要特點(diǎn),同時(shí)還伴有疲勞,注意力不集中,有較明顯的自殺欲望等其他癥狀的一種情感障礙類疾病[1],屬于中醫(yī)“郁證”、“臟躁”等疾病范疇。

抑郁癥的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，近年來(lái)，有研究認(rèn)為內(nèi)源性大麻素信號(hào)傳遞受損是引起抑郁癥癥狀的主要原因。現(xiàn)已證實(shí)，內(nèi)源性大麻素配體主要的水解酶之一——脂肪酞胺水解酶(FAAH)對(duì)內(nèi)源性大麻素信號(hào)強(qiáng)度的調(diào)節(jié)起著重要的作用[2]。研究表明，使用FAAH抑制劑或采用FAAH基因敲除的方法都能使實(shí)驗(yàn)大鼠產(chǎn)生抗焦慮和抗抑郁樣作用[3-4]。作為傳統(tǒng)療法針刺可以明顯改善抑郁癥患者的睡眠障礙，認(rèn)知障礙，焦慮，遲滯等癥狀[5]。針刺與單純抗抑郁藥物治療相比，有著安全，經(jīng)濟(jì)，副作用少的優(yōu)勢(shì)。本研究擬通過(guò)觀察電針對(duì)慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠腦組織中FAAH的影響，探討電針抗抑郁的可能機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SPF級(jí)SD雄性大鼠30只，體重(200±20) g。由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)為：SCXK(陜)2012-003。采用孤養(yǎng)方式單籠喂養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度18 ℃～23 ℃，相對(duì)濕度在50%～70%。動(dòng)物適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，接受1周飲用蔗糖水訓(xùn)練，防止動(dòng)物對(duì)糖水產(chǎn)生偏好。于實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食禁水12 h后，測(cè)晚間1h內(nèi)蔗糖水?dāng)z入量，根據(jù)每只老鼠蔗糖水?dāng)z入量，將所有動(dòng)物隨機(jī)分為空白組、模型組、模型+電針組。每組10只。

2 試劑與器械

2.1 主要試劑：Rabbit Anti-FAAH(一抗)(批號(hào)AF0304117，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，生物素化山羊抗兔IgG、SABC、DAB顯色試劑盒等(均為武漢博士德生物工程有限公司)。

2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備：華佗牌電針儀(SDZ-Ⅱ型)，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；研究級(jí)正置顯微鏡Zeiss Sxiolmager Al配Nikon DXM1200F；輪轉(zhuǎn)切片機(jī)R136型，湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司；Morris水迷宮(RD1101-MWM-M)，上海移數(shù)信息科技有限公司；TC-120S型智能程控生物組織自動(dòng)脫水機(jī)，湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司。

3 動(dòng)物模型制備 采用孤養(yǎng)結(jié)合慢性溫和不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激(CUMS)方法造模[6]。大鼠隨機(jī)接受21 d不同的應(yīng)激刺激，包括: 24 h禁食，24 h禁水，12 h的夜間光照，5 min的冷水游泳(4℃)， 30 min振蕩，2 min的夾尾，3 h的束縛。每天隨機(jī)安排1種刺激方式，在實(shí)驗(yàn)全程中每種刺激使用3次。

4 研究方法 ①空白組：正常喂養(yǎng)大鼠，共21 d。②模型組：建立CUMS抑郁癥大鼠模型，共21 d。③模型+電針組：于造模的第1天起，于每日上午進(jìn)行造模前1 h給予電針治療，再隨機(jī)進(jìn)行一種造模方法，共21 d。具體操作：選取“百會(huì)”、“內(nèi)關(guān)”、“陽(yáng)陵泉”,參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]、《大鼠圖譜的研制》[8]結(jié)合動(dòng)物比較學(xué)方法定位。各穴針刺得氣后，行電針治療，一側(cè)百會(huì)、內(nèi)關(guān)接一組電極，另一側(cè)內(nèi)關(guān)、陽(yáng)陵泉接一組電極，采用疏密波(疏波3Hz，密波15Hz)，電流量1.5mA，以引起大鼠肢體輕微抖動(dòng)為度，兩組交替。留針30 min，1次/d。

5 行為學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

5.1 蔗糖水?dāng)z入實(shí)驗(yàn):在實(shí)驗(yàn)第21天結(jié)束后，禁食禁水12 h，對(duì)各組大鼠檢測(cè)蔗糖水?dāng)z入量。每次檢測(cè)時(shí)，為避免動(dòng)物對(duì)飲水瓶的位置發(fā)生偏好，將兩個(gè)飲水瓶的位置進(jìn)行調(diào)換。

5.2 曠場(chǎng)試驗(yàn):制作周邊為80 cm×80 cm×40 cm的不透明立方型敞箱，在箱底用白線劃分為25塊面積相等的方格。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程在室內(nèi)隔音且安靜狀態(tài)下進(jìn)行，在敞箱底面的中心方格內(nèi)放置大鼠，然后記錄3 min內(nèi)大鼠的活動(dòng)。以大鼠雙后肢穿越敞箱底面的正方形塊數(shù)為水平穿越格數(shù)、以雙前肢離開(kāi)地面直立數(shù)作為大鼠的垂直豎立活動(dòng)次數(shù)，每只動(dòng)物在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中測(cè)2次，分別于實(shí)驗(yàn)前1天和實(shí)驗(yàn)第21天結(jié)束后進(jìn)行。

6 取材及指標(biāo)檢測(cè)

6.1 各大鼠組織樣品的制備:各組大鼠經(jīng)過(guò)行為學(xué)檢測(cè)后，將大鼠以l%戊巴比妥鈉按40 mg/kg經(jīng)腹腔注射麻醉。行4%多聚甲醛灌注固定后，剝離腦組織，分離出海馬體，放入多聚液中固定1 h后，進(jìn)行梯度脫水直至組織完全沉底。將海馬體用蠟塊包埋后，置于切片機(jī)上切成厚度5 μm的冠狀切片，常溫保存。

6.2 SABC免疫組織化學(xué)染色法:將上述的組織切片采用SABC免疫組化法檢測(cè)FAAH。其步驟：切片按常規(guī)步驟脫蠟至復(fù)水。PBS緩沖液浸泡5 min×2遍，純水室溫封閉5 min，純水沖洗3次?？乖迯?fù)。PBS緩沖液沖洗5 min，滴加BSA，室溫靜置30 min。甩掉液體，滴加一抗，4 ℃環(huán)境下過(guò)夜。PBS洗3次，每次2 min,滴加生物素化二抗，室溫靜置30 min。PBS洗3次，每次2 min，滴加試劑SABC，室溫靜置20 min。PBS液浸泡4遍，每次5 min。DAB顯色。脫水，透明，封片。

采用IPP6.0圖像分析軟件對(duì)FAAH的表達(dá)進(jìn)行定量分析。每張切片隨機(jī)取3個(gè)高倍視野(×400)，測(cè)定每個(gè)視野下染色的陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)。以每張片子3個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)的平均值作為該片子的測(cè)量值。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 22.0軟件，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差統(tǒng)計(jì)，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)，提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠蔗糖攝入量的變化 見(jiàn)表1。三組大鼠實(shí)驗(yàn)前蔗糖水?dāng)z入量無(wú)顯著差異(P>0.05)；空白組與模型組大鼠實(shí)驗(yàn)后的蔗糖水?dāng)z入量有極顯著差異(P<0.01)；模型組與電針組大鼠實(shí)驗(yàn)后蔗糖水?dāng)z入量有顯著差異(P<0.05)。

表1 實(shí)驗(yàn)前后蔗糖水?dāng)z入量變化(ml)

注：與空白組比較,*P<0.01；與模型組比較,#P<0.05

2 曠場(chǎng)試驗(yàn)(Open-field test) 由表2可見(jiàn),三組大鼠實(shí)驗(yàn)前水平穿越格數(shù)和豎立活動(dòng)次數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)；空白組與模型組大鼠實(shí)驗(yàn)后水平穿越格數(shù)和豎立活動(dòng)次數(shù)有極顯著差異(P<0.01)；模型組與電針組大鼠實(shí)驗(yàn)后水平穿越格數(shù)和豎立活動(dòng)次數(shù)有顯著差異(P<0.05)。

表2 實(shí)驗(yàn)前后曠場(chǎng)試驗(yàn)變化(格/次)

注：與空白組比較,*P<0.01；與模型組比較,#P<0.05

3 電針干預(yù)對(duì)各組大鼠海馬FAAH陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)平均值的影響 由表3和圖1可以看出, 空白組與模型組相比，其FAAH的陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)平均值有明顯差異(P<0.01)；模型組與電針組相比，其FAAH的陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)平均值有差異(P<0.05)；說(shuō)明FAAH含量的變化與抑郁癥有明顯關(guān)聯(lián)性，而電針干預(yù)可調(diào)節(jié)海馬中FAAH的表達(dá)。

表3 FAAH的陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)平均值(個(gè))

注：與空白組比較,*P<0.01；與模型組比較,#P<0.05

圖1 各組大鼠海馬中FAAH的表達(dá)(SABC染色，×400)

討 論

當(dāng)前圍繞抑郁癥構(gòu)建的動(dòng)物模型有多種，其中慢性輕度不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激(CUMS)抑郁模型,其原理更接近人類抑郁癥患者中慢性、低水平的應(yīng)激源促進(jìn)疾病發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，以人類抑郁癥的臨床核心癥狀即快感缺乏作為造模成功與否的關(guān)鍵[9]。本實(shí)驗(yàn)采用CUMS方法所造模型的模型組大鼠，其糖水消耗量減少，表明動(dòng)物獎(jiǎng)賞反應(yīng)水平減弱，其水平運(yùn)動(dòng)和豎立運(yùn)動(dòng)分值均下降，反映出其活動(dòng)度和對(duì)新鮮環(huán)境的好奇度減弱，與空白對(duì)照組大鼠在行為學(xué)方面的比較有顯著性差異。上述結(jié)果提示本模型造模成功。

目前，對(duì)于抑郁癥的發(fā)病機(jī)制還不太清楚,存在著很多的假說(shuō), 近年來(lái)又一新的假說(shuō)認(rèn)為內(nèi)源性大麻素信號(hào)傳遞受損是引起抑郁癥狀的主要原因。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)(ECS)主要包括大麻素受體1(CB1)和大麻素受體2(CB2)兩型受體,N-花生四烯酸氨基乙醇(AEA)和2-花生四烯酸甘油(2-AG)兩型配體,以及脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)和單酞基甘油脂酶 (MAGL)兩種相關(guān)的蛋白水解酶。大腦區(qū)域內(nèi)的2-AG主要由MAGL降解，也有一部分由FAAH降解。使用FAAH抑制劑或敲除FAAH基因均可對(duì)抑郁模型動(dòng)物在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、懸尾試驗(yàn)中產(chǎn)生顯著的抗抑郁作用[3-4]。強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中抑郁模型動(dòng)物的AEA含量顯著降低，在微量注射AEA后可緩解其抑郁樣表現(xiàn)。同時(shí)，有臨床研究也發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者FAAH-mRNA表達(dá)量明顯低于健康組，證實(shí)了FAAH-mRNA表達(dá)水平與抑郁癥患者的認(rèn)知障礙具有相關(guān)性[10]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)21 d的造模后，模型大鼠海馬組織內(nèi)FAAH的表達(dá)明顯低于正常大鼠，說(shuō)明內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)有損傷，與現(xiàn)有的研究結(jié)果一致。經(jīng)電針治療后，大鼠海馬組織內(nèi)FAAH的表達(dá)顯著高于模型組，說(shuō)明電針可以調(diào)節(jié)大鼠腦內(nèi)FAAH的表達(dá)。

抑郁癥在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中屬于“郁證”的范疇，中醫(yī)認(rèn)為，郁證病位在腦，發(fā)病與肝的關(guān)系最為密切，涉及心、脾，肝失疏泄、脾失健運(yùn)、心失所養(yǎng)、臟腑陰陽(yáng)氣血失調(diào)為本病主要病機(jī)。本研究通過(guò)電針百會(huì)、內(nèi)關(guān)、陽(yáng)陵泉三穴，激發(fā)經(jīng)絡(luò)氣機(jī)，以達(dá)到醒腦調(diào)神，疏肝理氣，安志解郁的功效。本研究結(jié)果表明，電針具有明顯的抗抑郁作用，其作用機(jī)理可能是通過(guò)對(duì)抗內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的損傷而實(shí)現(xiàn)的。