整合素基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性

張青松 朱傳衛(wèi) 王三六 趙吉光 沈俊 周琳

安徽宣城市中心醫(yī)院1檢驗(yàn)科，2腫瘤科，3普外科（安徽宣城242000）；4江蘇省太湖康復(fù)醫(yī)院檢驗(yàn)科（江蘇無(wú)錫214086）

胃癌（gastric cancer，GC）是我國(guó)高發(fā)的腫瘤之一，據(jù)最新統(tǒng)計(jì)顯示我國(guó)胃癌的發(fā)病率在腫瘤中位于第二位（男性第二，女性第四）［1］，嚴(yán)重地影響了群眾的健康。胃癌是一個(gè)復(fù)雜的疾病，其發(fā)病是一個(gè)慢性的病理過(guò)程?，F(xiàn)有研究顯示，胃癌的發(fā)病與是環(huán)境因素和遺傳因素相關(guān)。其中幽門(mén)螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）感染被證實(shí)為明確的胃癌致癌因子，被定為Ⅰ類(lèi)致癌因素。

整合素是細(xì)胞表面的異二聚體蛋白家族，其介導(dǎo)細(xì)胞與基質(zhì)及細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用。該家族蛋白的18 個(gè)α-亞單位及8 個(gè)β-亞單位形成25 種整合素［2］。整合素介導(dǎo)的信號(hào)對(duì)細(xì)胞的粘附、擴(kuò)散、遷移、增殖、分化、等都起到關(guān)鍵作用。此外，其還與多種腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移相關(guān)［3-4］。研究顯示整合素α1β1 的表達(dá)上調(diào)與胃腸道粘膜的炎癥相關(guān)并與胃癌的發(fā)生相關(guān)［5］。研究［6-7］顯示整合素的遺傳多態(tài)性與胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，亦有研究顯示［8］其與胃癌的治療及預(yù)后相關(guān)。因此進(jìn)一步探討整合素家族基因的遺傳多樣性與胃癌的發(fā)病及病理的相關(guān)性對(duì)于胃癌的發(fā)病機(jī)制及預(yù)后判斷有著重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 研究招募2013年7月至2018年6月于安徽宣城市中心醫(yī)院經(jīng)病理診斷為胃癌的患者設(shè)為病例組。同期招募在醫(yī)院健康體檢結(jié)果且無(wú)消化道疾病史者為健康對(duì)照組。上述二組人群均抽取以肝素抗凝的靜脈血，400 ×g 離心10 min，然后分別收集血細(xì)胞與血漿，凍存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)抗體檢測(cè)及基因分型。病例組組成為男186 例，女67 例，平均年齡（64.63 ± 12.17）歲。健康對(duì)照組組成為男213 例，女94 例，平均年齡（63.6±12.30）歲。

1.2 試劑和儀器 DNA 提取試劑盒購(gòu)自西安金磁納米生物技術(shù)有限公司；PCR 擴(kuò)增儀為美國(guó)ABI 公 司GeneAmp PCR System 9700 型。蛋白 核 酸檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；MassARRAY 平臺(tái)所用的點(diǎn)樣儀及質(zhì)譜儀為美國(guó)Sequenom 公司產(chǎn)品；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；Iplex Gold Reagent kit 為美國(guó)Sequenom 公司產(chǎn)品。幽門(mén)螺桿菌檢測(cè)試劑盒由上海凱創(chuàng)生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.3 樣本DNA提取 所有受試者取抗凝全血3 mL分離得到的白細(xì)胞，基因組DNA 提取采用GoldMag全血基因組DNA 提取試劑盒，按照試劑說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行，主要步驟如下：（1）破碎紅細(xì)胞：向加入紅細(xì)胞裂解液，充分裂解后以500 ×g離心10 min，棄上清，留下沉淀；（2）破碎白細(xì)胞：向步驟1 管中加入白細(xì)胞裂解液及蛋白酶K，用以破碎白細(xì)胞；（3）清洗磁粒：取1 mL 充分搖勻的磁性微粒加入到一新離心管中，置于磁性分離器上，待溶液澄清后棄去上清，并向離心管中按一定的比例加入結(jié)合液BC，將離心管置于渦旋振蕩器上渦旋混勻15 s 后備用；（4）結(jié)合：將步驟3 中處理好的磁性微粒轉(zhuǎn)移到裝有步驟2 中已裂解的樣本離心管中，將離心管置于渦旋振蕩器上渦旋混勻15 s 后室溫放置5 min，然后將離心管置于磁性分離器上磁性分離5 min，待溶液澄清后棄去上清；（5）清洗Ⅰ：向離心管中加入清洗液并混勻15 s后置于磁性分離器上磁性分離，待溶液澄清后棄上清；（6）清洗Ⅱ：向離心管中加入清洗液Ⅱ，混勻15 s 后置于磁性分離器分離棄上清；（7）洗脫：加入洗脫液，混勻15 s 后置于磁性分離器上，收集上清中的DNA 到1.5 mL 離心管中，將離心管置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆??；蚪M提取后采用NaniDrop2000c 型蛋白核酸檢測(cè)儀并分析其純度與濃度。

1.4 多態(tài)性位點(diǎn)的選擇與分析基因多態(tài)性位點(diǎn)選擇 以中國(guó)人群最小等位基因頻率為0.05?；蚨鄳B(tài)性位點(diǎn)位于整合素家族基因上，見(jiàn)表1。所選擇的基因分型采用美國(guó)Sequenom 公司MassARRAY 平臺(tái)進(jìn)行分析。該平臺(tái)分析基因型主要為以下幾個(gè)步驟：（1）PCR 擴(kuò)增反應(yīng)：采用多重PCR 擴(kuò)增含有多態(tài)性位點(diǎn)的序列片斷；（2）SAP 純化：SAP是一個(gè)純化的過(guò)程，主要采用蝦堿酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）來(lái)消化PCR 擴(kuò)增體系中多與的dNTPs 和引物；（3）Iplex 單堿基延伸反應(yīng)：利用多重PCR 擴(kuò)增后的產(chǎn)物，針對(duì)該位點(diǎn)再設(shè)計(jì)一條延伸引物，延伸引物在iplex 酶的作用下進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。根據(jù)SNP 位點(diǎn)的不同，探針將結(jié)合不同的ddNTP，從而具有不同的分子量，質(zhì)譜儀即可檢測(cè)出這種分子量差異，從而實(shí)現(xiàn)SNP 分型的目的；（4）樹(shù)脂純化：向每個(gè)反應(yīng)體系中加入Clean Resin（樹(shù)脂），混勻15 min 后離心5 min，其目的是為了去除前三步反應(yīng)中殘余的雜質(zhì)；（5）點(diǎn)樣：使用MassArray 點(diǎn)樣儀將制備好的樣本點(diǎn)到檢測(cè)芯片的相應(yīng)位置上；（6）質(zhì)譜分析：利用MALDI產(chǎn)生離子常用飛行時(shí)間（Time-of-Flight，TOF）檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)不同的核酸片斷，不同的等位基因會(huì)產(chǎn)生不同的質(zhì)譜牲，從而得到相應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果；（7）結(jié)果分析：使用SequenomTyper 4.0 Software 觀看和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出不同的基因型。

表1 多態(tài)性位點(diǎn)信息Tab.1 Information of polymorphisms

1.5 Hp 感染檢測(cè) 采用膠體金法，嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作并判讀結(jié)果。主要步驟如下：用加樣吸管往加樣孔內(nèi)垂直滴加1 滴（大約20 μL）。然后立即垂直加入3～4 滴樣品稀釋液，加樣后5 min 判斷結(jié)果；判讀陽(yáng)性為質(zhì)控線（C 線）和檢測(cè)線（T 線）各有一條紅色線條出現(xiàn)，表明樣本中存在胃幽門(mén)螺旋桿菌尿素酶抗體。判讀陰性為只有質(zhì)控線（C 線）有一條紅色線條，而檢測(cè)線（T 線）無(wú)紅色線條出現(xiàn)，則指示胃幽門(mén)螺旋桿菌尿素酶抗體或胃幽門(mén)螺旋桿菌尿素酶抗體低于檢出水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 11.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)、百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。對(duì)照組的各多態(tài)性位點(diǎn)的基因型采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢測(cè)。采用二分類(lèi)因變量Logistic 回歸分析多態(tài)性位點(diǎn)的與胃癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，以風(fēng)險(xiǎn)比（OR）及95%可信區(qū)間（CI）表示相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 病例組及健康對(duì)照組的性別、年齡、吸煙等方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），但病例組的飲酒者比例顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組中H.pylori 感染陽(yáng)性為151 例（49.19%），病例組為132 例陽(yáng)性（52.17%），二組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)對(duì)對(duì)照組進(jìn)行Hardy-Weinberg 遺傳平衡（HWE）檢驗(yàn)，結(jié)果顯示各位點(diǎn)均符合該定律（P＞0.05），認(rèn)為具有群體代表性，見(jiàn)表2。病例組依臨床分期T1-T2 為79 例（31.23%），T3-T4 為174 例（68.77%）。依據(jù)臨床部位為賁門(mén)癌80 例（31.62%），非賁門(mén)癌173 例（68.38%）。

表2 胃癌組及健康對(duì)照組的臨床資料Tab.2 Clinical characteristics of participants 例（%）

2.2 各基因型在病例組及對(duì)照組中的分布及其與胃癌易感性關(guān)系 ITGA1rs2447867 位點(diǎn)在病例與對(duì)照組的分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，Logistic 回歸分析顯示rs244786TC（校正后OR= 1.69，95%CI：1.16～2.45，χ2=7.574，P=0.006）、TT（校正后OR=2.23，95%CI：1.25～4.00，χ2=7.303，P=0.007）及TC/TT（校正后OR=1.75，95%CI：1.23～2.50，χ2=9.411，P= 0.002）基因型與胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。其他各位點(diǎn)的基因型分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

2.3 ITGA1rs2447867 位點(diǎn)的亞組分析 ITGA1 rs2447867 位點(diǎn)經(jīng)亞組進(jìn)行l(wèi)ogistic 回歸分析顯示，年齡＞60 歲組各基因型均胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)（TCvs.CC：校正后OR=2.05，95%CI：1.27～2.31，χ2= 8.507，P= 0.003；TTvs.CC：校正后OR= 2.58，95%CI：1.18～5.63，χ2= 5.667，P= 0.017；TC/TTvs.CC：校正后OR= 2.07，95%CI：1.31～3.28，χ2=9.702，P= 0.002），而在年齡≤60 歲組，僅有TT 基因型與胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)（TTvs.CC：校正后OR=2.90，95%CI：1.09～7.67，χ2=1.580，P=0.032）。此外在腫瘤部位分組中亦顯示，在非賁門(mén)癌中，各基因型均與胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)（TCvs.CC：校正后OR= 1.78，95%CI：1.17～2.72，χ2=7.191，P=0.007；TTvs.CC：校正后OR=2.68，95%CI：1.41～5.08，χ2= 9.080，P= 0.003；TC/TTvs.CC：校正后OR=1.90，95%CI：1.27～2.84，χ2=9.746，P=0.002），而在賁門(mén)癌中見(jiàn)未相關(guān)性。該位點(diǎn)在其他分組中分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表4。

3 討論

本研究采用病例-對(duì)照分析了整合素基因家族5 個(gè)基因的多態(tài)性位點(diǎn)與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，ITGA1rs2447867 多態(tài)性位點(diǎn)是胃癌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)因素。進(jìn)一步亞組分析顯示，該位點(diǎn)與年齡＞60 歲的人群胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，且與非賁門(mén)癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。

ITGA1 位于染色體5q11.2，其編碼整合素的α1 亞單位。研究顯示其與胃癌細(xì)胞粘附及轉(zhuǎn)移相關(guān)［9］。此外，在韓國(guó)人群的一項(xiàng)研究中也發(fā)現(xiàn)ITGA1rs2447867 與胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)［7］，與本研究結(jié)果相一致。對(duì)其功能研究推測(cè)該位點(diǎn)是一個(gè)外顯子拼接增強(qiáng)子，導(dǎo)致蛋白翻譯后剪切的異常，因此與胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)［7］。整合素是細(xì)胞粘附分子主要倡導(dǎo)細(xì)胞之間、細(xì)胞與胞外基質(zhì)及細(xì)胞與病原體的相互作用，其在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，如介導(dǎo)白細(xì)胞遷移、突觸形成、吞噬作用等［10］，因此在病原體感染導(dǎo)致胃部疾病進(jìn)展乃至胃癌的發(fā)生過(guò)程中，整合素作為介導(dǎo)細(xì)胞間的作用及免疫系統(tǒng)的改變發(fā)揮著重要作用［11］。ITGA1編碼整合素受體的α1 亞單位，其與β1 亞單位形成一個(gè)異源二聚體進(jìn)而與膠原及層粘連蛋白結(jié)合，參與細(xì)胞之間的粘附并在介導(dǎo)免疫與纖維化的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮作用。該基因還被證實(shí)與膠原相互作用，調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白的活性與腫瘤的發(fā)生相關(guān)［12］。亦有研究報(bào)道，整合素α1β1 在胃腸道炎癥過(guò)程中表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而與胃癌的發(fā)生有潛在的關(guān)聯(lián)［5］。此外，細(xì)胞及臨床研究進(jìn)一步證實(shí)整合素α1 亞單位陽(yáng)性胃癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附是其腹部轉(zhuǎn)移的重要過(guò)程［9，13］。綜合以上，雖然ITGA1 rs2447867 多態(tài)性位點(diǎn)的功能尚待研究，但現(xiàn)有研究顯示ITGA1 在胃癌的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，可以通過(guò)多個(gè)潛在的機(jī)制導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。ITGA1rs2432143 位于ITGA1 基因內(nèi)含子1 內(nèi)，在韓國(guó)人群中報(bào)道該位點(diǎn)與胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)［7］，而該位點(diǎn)的功能目前還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。本研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，該位點(diǎn)目前還未見(jiàn)相關(guān)的研究報(bào)道，有待于今后的研究進(jìn)一步證實(shí)。

表3 基因型分布及其與胃癌風(fēng)險(xiǎn)性的關(guān)系Tab.3 Genotypes distribution and it′s association with GC risk例（%）

rs1126643 是一個(gè)位于ITGA2 外顯子7 的C/T基因多態(tài)性，導(dǎo)致一個(gè)無(wú)義的多態(tài)性位點(diǎn)（Phe253Phe）?，F(xiàn)有研究提示該多態(tài)性位點(diǎn)也心血管疾病及阿司匹林藥效有關(guān)［14］。迄今為止，尚未見(jiàn)其與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性研究。rs3809865 與rs2675 分別位于ITGB3 基因ITGB5 基因的3′非編碼區(qū)（3′UTR）與基因的表達(dá)有潛在的相關(guān)性［15］，有研究報(bào)道二個(gè)位點(diǎn)與口腔鱗癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)［16］。rs17664 位點(diǎn)ITGA6 基因的3′UTR 區(qū)，有研究報(bào)道rs3809865，rs2675 及rs17664 而亦有研究報(bào)道這二個(gè)位點(diǎn)與胃癌的發(fā)病有潛在的相關(guān)性［17］，與本研究的結(jié)論不一致，這可能與研究的方法（該研究采用高分辨溶解曲線法）、納入研究的群體的年齡及地區(qū)（四川）的差別有關(guān)。上述研究結(jié)果目前鮮有研究報(bào)道，有待于進(jìn)一步證實(shí)。

表4 ITGA1rs2447867 位點(diǎn)與胃癌風(fēng)險(xiǎn)的亞組分析Tab.4 Subgroup analysis of the assoication between ITGA1rs2447867 and GC risk

本研究還通過(guò)亞組分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ITGA1-rs2447867 多態(tài)性位點(diǎn)與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系與年齡及胃癌的發(fā)生部位相關(guān)，該位點(diǎn)與在年齡較大人群（＞60 歲）的胃癌及與非賁門(mén)癌相關(guān)胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。眾所周知，個(gè)體的年齡越大，所受到環(huán)境因素的影響積累就越多，這其中其中環(huán)境因素（如吸煙、飲酒、Hp 感染）、遺傳因素及其二者的相互作用是胃癌發(fā)病的重要原因［18-19］，隨著年齡的增長(zhǎng)個(gè)體的環(huán)境暴露時(shí)間增加，此會(huì)導(dǎo)致個(gè)體的胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加。就胃癌的發(fā)病部位而論，有研究顯示賁門(mén)癌與非賁門(mén)癌在致病因素及分子表型方面有顯著的差異［20］，且二者在發(fā)病因素上亦有很大差異，如肥胖［21］、Hp 感染［22］等因素在二者發(fā)病的過(guò)程中起著不同的作用。此外，研究［23］還顯示，二類(lèi)胃癌在免疫表型上有很大差異，非賁門(mén)癌的發(fā)生更傾向于與炎癥相關(guān)?；谖覈?guó)人群的流行病學(xué)調(diào)查顯示，既往患消化道潰瘍、慢性胃炎為非賁門(mén)癌最強(qiáng)的危險(xiǎn)因素［24］，提示炎癥在非賁門(mén)癌的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，而ITGA1 在介導(dǎo)炎癥過(guò)程發(fā)揮重要作用，以上結(jié)論與本研究ITGA1rs2447867 與非賁門(mén)癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的結(jié)果一致。

胃癌的發(fā)病因素復(fù)雜，本研究探討的ITGA1rs2447867 位點(diǎn)的功能尚沒(méi)有研究報(bào)道。另外，本研究所納入的病例還相對(duì)較少，這些都是本研究的薄弱之處。本研究的結(jié)果還有待于更大樣本量的分子流行病學(xué)研究及相關(guān)的功能研究的證實(shí)。

綜合以上，本研究結(jié)果顯示ITGA1rs2447867多態(tài)性位點(diǎn)與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，且風(fēng)險(xiǎn)在年齡＞60 歲人群中增大，該位點(diǎn)與非賁門(mén)胃癌有更強(qiáng)的相關(guān)性。本研究的結(jié)論為胃癌發(fā)病的基礎(chǔ)研究提供了分子流病學(xué)資料，為胃癌發(fā)病的分子機(jī)制研究提供了臨床資料。