棕櫚酸經(jīng)過氧化物酶體增殖物激活受體α影響KGN細(xì)胞SR-BI 的表達(dá)和脂質(zhì)含量

劉琪 莫中成 郭冰冰 屈麗華 廖宏慶 謝遠(yuǎn)杰 張蒙夏

南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院應(yīng)用解剖與生殖醫(yī)學(xué)研究所，組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室（湖南衡陽421001）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種最常見的內(nèi)分泌和代謝紊亂疾病，在中國人肥胖患者中患病率約為60%～70%［1-2］。據(jù)報道PCOS 與脂質(zhì)代謝受損有關(guān)，脂肪酸的急劇增加導(dǎo)致PCOS 患者的脂質(zhì)變化顯著［3-4］。研究表明，過多的脂肪酸在體內(nèi)積累，引起脂毒性，從而影響PCOS 的發(fā)生發(fā)展，并且增加循環(huán)游離脂肪酸有許多不良代謝作用，包括血脂異常、胰島素抵抗、2 型糖尿病、不孕和高血壓［5-7］。

棕櫚酸作為長鏈脂肪酸的一種，是一種含十六碳的機(jī)體內(nèi)最常見的飽和脂肪酸。棕櫚酸分布在體內(nèi)和組織內(nèi)，其代謝主要是經(jīng)過β 氧化供給能量［8］。棕櫚酸在正常的范圍內(nèi)，發(fā)揮其生理功能，但是在一些特定的病理條件下，組織內(nèi)的棕櫚酸異常增加，其穩(wěn)態(tài)被打破，脂毒性會增加，導(dǎo)致相關(guān)疾病的產(chǎn)生。目前已知相關(guān)的疾病有肥胖型心肌病、高脂血癥、糖尿病以及腫瘤。有研究報道，棕櫚酸存在卵巢組織中，正常情況下它用于能量的供應(yīng)，但是過多的棕櫚酸能導(dǎo)致顆粒細(xì)胞凋亡［9］。并且，研究發(fā)現(xiàn)血漿中棕櫚酸會增加，卵泡液中棕櫚酸的濃度也會受血漿濃度的影響，對顆粒細(xì)胞的活性產(chǎn)生負(fù)面的作用［10］。在多囊卵巢綜合征患者中，棕櫚酸在卵泡液中增加，對卵泡的發(fā)育產(chǎn)生影響［11］。

人類SR-BI 基因位于染色體12q24，約75 kDa，B類Ⅰ型清道夫受體（scavenger receptor class B type I，SR-BI）的結(jié)構(gòu)呈馬蹄形，由1個胞外域、2個跨膜域、2 個胞漿域構(gòu)成［12］。先前的研究發(fā)現(xiàn)SR-BI 用于攝取培養(yǎng)的大鼠原代顆粒細(xì)胞中的膽固醇酯用于類固醇合成，并且缺乏SR-BI 的小鼠具有異常的脂蛋白代謝和可逆的女性不育［13］。研究發(fā)現(xiàn)SRBI 敲除后引起高膽固醇血癥，并且女性SR-BI 敲除后導(dǎo)致不孕。證實在卵母細(xì)胞回收過程中分離的顆粒細(xì)胞中具有SR-BI RNA 低表達(dá)的不育婦女的血漿雌二醇水平顯著降低，并且回收和受精的卵母細(xì)胞數(shù)量較低［14］。在肝細(xì)胞中，高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）介導(dǎo)的膽固醇流出的可能機(jī)制是，甾醇載體蛋白-29（sterol carrier protein-2，SCP-2）［15］和脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acidbinding protein，F(xiàn)ABP）［16］能影響SR-BI 的表達(dá)，從而介導(dǎo)膽固醇流出。此外，研究發(fā)現(xiàn)SR-BI 刺激游離膽固醇從穩(wěn)定表達(dá)SR-BI 的中國倉鼠卵巢細(xì)胞中流出［17］。因此，說明SR-BI 是影響顆粒細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運的重要蛋白，但是脂肪酸是否會影響其表達(dá)未見報道。

過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferators-activated receptor α，PPARα），PPARα屬于核受體蛋白主要參與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的調(diào)控，PPARα在糖、脂、蛋白質(zhì)代謝中起重要的作用。通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）信號傳導(dǎo)途徑，在許多組織中脂肪酸氧化受到調(diào)節(jié)［18］。CHINETTI 等［19］發(fā)現(xiàn)PPARα激活降低ACAT1 活性和降低酯化速率，但不改變ACAT1 基因表達(dá)，還表明PPARα 配體促進(jìn)ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1（ATP-binding cassette transporterA1，ABCA1）的蛋白質(zhì)表達(dá)，從而增強膽固醇流出。在他們的另一項研究中，PPARα激活劑誘導(dǎo)SR-BI 的表達(dá)。但是，對于PPARα影響顆粒細(xì)胞脂質(zhì)轉(zhuǎn)運、攝取、氧化的作用仍不清楚?？偠灾?，這些研究說明PPARα在卵巢中脂質(zhì)代謝中扮演者重要的角色。

綜上所述，本研究旨在探討棕櫚酸在卵巢顆粒細(xì)胞中的作用，為防止卵巢脂質(zhì)代謝障礙疾病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人卵巢顆粒細(xì)胞購于BNCC 公司。

1.2 試劑與儀器 DMEM 培養(yǎng)基購自美國gibco公司；棕櫚酸、油紅O 染料、青霉素-鏈霉素購自美國Sigma 公司；胎牛血清購自上海依科賽生物科技有限公司；抗體：SR-BI 購買于英國Abcam 公司，PPARα購自武漢三鷹；NBD-Choleaterol 購自美國Cayman。

倒置相差顯微鏡購自美國Olympus 公司，Carl Zeiss 熒光顯微鏡購自德國蔡司公司，低速離心機(jī)（LXJ-04）購自上海博迅實業(yè)有限責(zé)任公司設(shè)備廠，Tanon 5500 全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和棕櫚酸溶解 將加入4 mL 含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基的KGN 細(xì)胞置于5%CO237 ℃恒溫?zé)o菌培養(yǎng)箱中。通過細(xì)胞計數(shù)，將1 × 106/mL 細(xì)胞密度的細(xì)胞懸液接種到6 孔板，2 mL/孔接種細(xì)胞懸液。棕櫚酸溶解：先用0.1 mol/L NaOH 在70 ℃水浴5 min，趁熱加到55 ℃的10%BSA 中，配成10 mol/L 的儲備液待用，過濾后可放入-20 ℃凍存，處理細(xì)胞前加熱溶解至無結(jié)晶。

1.3.2 油紅O 染色 將KGN 細(xì)胞按細(xì)胞傳代的方法離心后，吸去上清，每管均加入12 mL 無血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液。另取一塊無菌6 孔板，每孔均放入已消毒蓋玻片一塊，然后每孔均加入KGN細(xì)胞懸液2 mL，待貼壁并密度達(dá)到50%時，加入棕櫚酸處理，用PBS 溶液輕輕洗滌細(xì)胞2 次，加4%的多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，以PBS 溶液清洗3 次后，加稀釋好的油紅O 工作液于37 ℃恒溫箱染色15～30 min，60%異丙醇漂洗5 s 或者去離子水清洗3 次，用蘇木素染核5～7 min 后去離子水清洗5 min，0.5%鹽酸酒精快速分色并以清水返藍(lán)后，自然風(fēng)干后滴加甘油封片，在顯微鏡下觀察，胞內(nèi)的橙紅色顆粒即為脂滴，拍照并保存。

1.3.3 KGN 細(xì)胞NBD-Cholesterol 標(biāo)記熒光 將KGN 細(xì)胞按細(xì)胞傳代的方法離心后，吸去上清，每管均加入12 mL 無血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液。另取一塊無菌6 孔板，每孔均放入已消毒蓋玻片一塊，然后每孔均加入KGN 細(xì)胞懸液2 mL，待貼壁并密度達(dá)到50%時，加入棕櫚酸處理，再加相應(yīng)處理因素處理一定時間后，以100～200 μL NBDCholesterol 工 作液 干預(yù)KGN 細(xì) 胞12 h 后，預(yù) 熱的PBS 清洗2 次。之后加相應(yīng)處理因素處理一定時間后，用PBS 溶液輕輕洗滌細(xì)胞2 次，避光，立即熒光顯微鏡下拍照。

1.3.4 免疫熒光檢測蛋白的表達(dá) 取一無菌6 孔板，每孔置一塊無菌玻片，按細(xì)胞傳代的方法將細(xì)胞離心后，棄上清，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，吹打混勻后，每孔加入2 mL 細(xì)胞懸液，經(jīng)棕櫚酸處理后，加相應(yīng)的處理因素處理一段時間，PBS 洗滌細(xì)胞2 次，并加入4%甲醛室溫固定30 min，再次用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入10%山羊血清（PBS配制）室溫封閉20 min。其后用SR-BI抗體（1∶1 000，10%山羊血清配制）、PPARα（1∶500）室溫孵育1 h 或4 ℃過夜。接著PBS 洗滌3 次，每次5 min，加入二抗Cy3-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG（H+L）（1∶500，10%山羊血清配制）室溫避光孵育1 h。PBS 洗滌3 次（避光），每次5 min，立即熒光顯微鏡下拍照或防淬滅封片劑封片。

1.3.5 Western Blot 免疫印跡 將KGN 細(xì)胞接種在6 孔板中，經(jīng)棕櫚酸處理后，再加相應(yīng)的處理因素處理一段時間。將進(jìn)行樣品的上樣、電泳及轉(zhuǎn)膜。在4 ℃冰箱中，將膜與SR-BI 一抗（1∶2 000）、PPARα一抗（1∶1 000）及β-Actin（1∶1 000）、HSP70（1∶5 000）過夜孵育，第2 天進(jìn)行二抗的孵育。通過Image J 軟件定量免疫印跡的信號強度。

1.3.6 免疫細(xì)胞化學(xué) 將KGN 細(xì)胞接種在6 孔板中，待密度到達(dá)50%左右，經(jīng)棕櫚酸處理，再加相應(yīng)的處理因素處理一段時間。用PBS 洗滌細(xì)胞2 次，并加入4%甲醛室溫固定30 min，再次用PBS洗滌細(xì)胞3 次，使用0.01% Triton 打孔10 min，PBS洗滌細(xì)胞3 次，H2O2室溫孵育10 min，PBS 洗滌細(xì)胞3 次，將SR-BI（1∶400）一抗，PPARα一抗（1∶500）4 ℃過夜，次日，復(fù)溫30 min，PBS洗滌細(xì)胞3次，滴加增強劑，37 ℃孵育20 min，PBS洗滌細(xì)胞3次，滴加二抗，PBS洗滌細(xì)胞3次，DAB顯色，復(fù)染，分色，拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 計量資料數(shù)據(jù)表示為x ± s，所有實驗重復(fù)3 次；數(shù)據(jù)都使用Student′st-檢驗和單因素方差分析進(jìn)行分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 棕櫚酸對KGN 細(xì)胞脂質(zhì)含量及脂質(zhì)流出的影響 為探索棕櫚酸對KGN 細(xì)胞脂質(zhì)的影響，采用不同濃度（0、0.000 1、0.000 2、0.000 3 mol/L）處理KGN 細(xì)胞，采用油紅O 染色法檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，細(xì)胞體積增大，胞內(nèi)脂滴數(shù)量增加，且隨著棕櫚酸濃度的增加胞內(nèi)脂滴數(shù)量增加更為明顯（圖1A）。用NBD-Cholesterol孵育KGN 細(xì)胞后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)熒光的強度，發(fā)現(xiàn)隨著棕櫚酸濃度的增加，胞內(nèi)綠色熒光強度逐漸增加（圖1B），提示胞內(nèi)脂質(zhì)的含量逐漸增加。說明棕櫚酸促進(jìn)KGN 細(xì)胞脂質(zhì)增加，且其效應(yīng)具有濃度依賴性。

圖1 棕櫚酸對顆粒細(xì)胞脂質(zhì)含量的影響Fig.1 The effect of PA on lipid deposition and lipid outflow in KGN cells

2.2 棕櫚酸對KGN細(xì)胞SR-BI表達(dá)的影響 KGN細(xì)胞脂質(zhì)轉(zhuǎn)運是受多種基因及蛋白調(diào)控的復(fù)雜過程，其中SR-BI 是促KGN 細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵蛋白。為進(jìn)一步探討棕櫚酸抑制KGN 細(xì)胞脂質(zhì)流出的作用機(jī)制，將KGN 細(xì)胞用不同濃度的棕櫚酸（0、0.000 1、0.000 2、0.000 3 mol/L）處理24 h，采用Western Blot 免疫熒光和免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測KGN 細(xì)胞SR-BI 的表達(dá)，與對照組相比發(fā)現(xiàn)，隨著棕櫚酸處理濃度的增加，細(xì)胞膜上SR-BI 表達(dá)逐漸增加（圖2），這說明棕櫚酸呈濃度依賴性的方式促進(jìn)KGN 細(xì)胞SR-BI 的表達(dá)。

2.3 棕櫚酸對KGN 細(xì)胞PPARα的表達(dá)的影響為明確PPARα是否參與了棕櫚酸促進(jìn)KGN 細(xì)胞的脂質(zhì)增加，將KGN 細(xì)胞用不同濃度的棕櫚酸（0、0.000 1、0.000 2、0.000 3 mol/L）處理24 h，采用Wetern Blot 和免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測KGN 細(xì)胞PPARα的表達(dá)。與對照組相比發(fā)現(xiàn)，隨著棕櫚酸處理濃度的增加，細(xì)胞上PPARα表達(dá)逐漸增加（圖3），這說明棕櫚酸呈濃度依賴性的方式促進(jìn)KGN 細(xì)胞PPARα的表達(dá)。

圖2 棕櫚酸對顆粒細(xì)胞SR-BI 蛋白表達(dá)的影響Fig.2 The effect of PA on the expression of SR-BI in KGN cells

3 討論

體內(nèi)游離脂肪酸分布不均衡直接導(dǎo)致了心臟及外周器官細(xì)胞脂質(zhì)含量增加，并轉(zhuǎn)化為甘油三酯［20］。脂肪酸在顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞發(fā)育中扮演著重要的角色，但是過量的FFA 是有害的，研究發(fā)現(xiàn)卵泡游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）升高的女性患有子宮內(nèi)膜異位癥［21-22］。JUNGHEIM 等［23］研究發(fā)現(xiàn)卵巢濾泡中的主要FFA 與血清中的FFA 一致，卵泡細(xì)胞以不同的速率代謝特異性FFA，或者某些FFA 可能優(yōu)先轉(zhuǎn)運到卵巢濾泡中，總FFA 升高與卵丘復(fù)合體質(zhì)量較差之間存在關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步表明過量FFA對卵巢濾泡功能有不利影響。HOLTE等［24］發(fā)現(xiàn)多囊卵巢綜合征患者中，血漿FFA 濃度是增加的。研究發(fā)現(xiàn)將人顆粒細(xì)胞用0.000 1 mol/L或0.000 3 mol/L PA 培養(yǎng)48 h，棕櫚酸誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡伴隨著抑凋亡蛋白（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）的下調(diào)和促凋亡蛋白（apoptosis regulator BAX，Bax）的上調(diào)［25］。這些結(jié)果表明飽和的FFA 誘導(dǎo)由各自的?；o酶A 形式的代謝引起的人顆粒細(xì)胞的凋亡，因此循環(huán)FFA 在人顆粒細(xì)胞的凋亡中起關(guān)鍵作用。劉艷等［26］研究發(fā)現(xiàn)棕櫚酸能導(dǎo)致炎癥。而棕櫚酸作為一種飽和脂肪酸，它既是顆粒細(xì)胞所必需的，但過多棕櫚酸會影響顆粒細(xì)胞功能。在本研究中，不同于其他研究，發(fā)現(xiàn)棕櫚酸影響顆粒細(xì)胞脂質(zhì)代謝，促進(jìn)顆粒細(xì)胞脂質(zhì)含量增加。同時，XIE 等［27］發(fā)現(xiàn)用0.5 mmol/L棕櫚酸酯處理初級顆粒細(xì)胞48 h 或96 h，細(xì)胞凋亡增加。此外，研究報道棕櫚酸濃度升高會增加IL-1在卵巢顆粒細(xì)胞中，其機(jī)制可能與顆粒細(xì)胞神經(jīng)酰胺積累增加有關(guān)［28］。在本實驗研究中，發(fā)現(xiàn)棕櫚酸用0.000 1、0.000 2、0.000 3 mol/L 培養(yǎng)24 h，顆粒細(xì)胞中脂質(zhì)含量顯著增加。本研究中棕櫚酸的濃度比較低，在預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)按照文獻(xiàn)中高濃度的棕櫚酸導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這說明用低濃度棕櫚酸處理影響顆粒細(xì)胞脂質(zhì)含量，增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量。

圖3 棕櫚酸對顆粒細(xì)胞中PPARα 蛋白表達(dá)的影響Fig.3 The effect of PA on the expression of PPARα in KGN cells

SR-BI 是細(xì)胞膜上清道夫受體，它主要介導(dǎo)膽固醇選擇性轉(zhuǎn)移，但其機(jī)制尚未明確，可能需要輔助蛋白和脂質(zhì)的參與，質(zhì)膜的物理化學(xué)特性的改變和SR-BI 的物理形式。HU 等［29］報道75%的SR-BI 傳遞的HDL-膽固醇酯被非溶酶體中性膽固醇酯水解酶水解成游離膽固醇和長鏈不飽和脂肪酸，脂肪酸可用于能量代謝或許再酯化，儲存在脂滴中。既往研究報道SR-BI 參與選擇性膽固醇轉(zhuǎn)運，關(guān)于脂肪酸是否可通過SR-BI 影響顆粒細(xì)胞脂質(zhì)變化還尚無報道。本研究發(fā)現(xiàn)隨著棕櫚酸的濃度增加，SR-BI 的表達(dá)上調(diào)，說明顆粒細(xì)胞中SR-BI與脂質(zhì)含量的增加密切相關(guān)。但DE FRONZO 等［30］報道脂肪酸與清道夫受體密切相關(guān)，其中清道夫受體分化群36（CD36）是脂肪酸的膜受體，CD36在細(xì)胞膜攝取脂肪酸進(jìn)入細(xì)胞成為脂滴，參與顆粒細(xì)胞的脂質(zhì)代謝。WEN 等［31］研究發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸誘導(dǎo)了時間和劑量依賴性H9c2 細(xì)胞的脂毒性；增強的CD36 和減少短時間后葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4 型（glucose transporter 4，GLUT4）途徑蛋白水平。SR-BI作為清道夫受體家族的成員，它并不是脂肪酸的膜受體，但是在本研究中發(fā)現(xiàn)棕櫚酸影響顆粒細(xì)胞SR-BI 的表達(dá)，隨著棕櫚酸濃度的增加，其表達(dá)顯著上調(diào)，棕櫚酸可能通過結(jié)合其受體進(jìn)而影響顆粒細(xì)胞的SR-BI 的表達(dá)。這些說明SR-BI 是棕櫚酸致顆粒細(xì)胞脂質(zhì)含量增加的重要靶蛋白。

過氧化物酶體增殖物激活受體是核受體家族，其通過結(jié)合天然配體（例如多不飽和脂肪酸或通過合成配體）而被激活［32］。FFA 是過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）的內(nèi)源性配體［33］，PPAR 在哺乳動物的卵巢和胎盤發(fā)育過程中起重要作用［32，34］。對于PPARα，VITTI 等［35］通過小鼠卵巢的體內(nèi)實驗表明，非諾貝特抑制卵巢雌激素合成酶的基因表達(dá)。PPARα表達(dá)在顆粒細(xì)胞中，但其表達(dá)非常低［36］，已證實它的激活是負(fù)責(zé)減少FFA 的表達(dá)和活性［37］。因此，PPARα的上調(diào)能夠改善在卵泡微環(huán)境和生理或病理卵巢老化期間受到損害氧化能量代謝［38］。WEN 等［31］研究報道在心肌細(xì)胞中，棕櫚酸下調(diào)PPARα蛋白的表達(dá)，HDL 治療顯著增加CD36 代謝途徑蛋白質(zhì)和減少GLUT4 途徑蛋白質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，PPARα蛋白在正常顆粒細(xì)胞中低表達(dá)，但經(jīng)棕櫚酸處理后，PPARα蛋白的表達(dá)呈棕櫚酸濃度依賴性增加。這與其他文獻(xiàn)中的結(jié)果不一致，PPARα不僅在顆粒細(xì)胞能量代謝中扮演者重要的角色，參與了顆粒細(xì)胞脂質(zhì)轉(zhuǎn)運障礙，導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)含量增加，阻礙顆粒細(xì)胞的功能，并且調(diào)控SR-BI 蛋白的表達(dá)。其潛在的機(jī)制是棕櫚酸通過結(jié)合受體（CD36 或者脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白）進(jìn)入細(xì)胞，通過激活PPARα，從而影響SR-BI 蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致顆粒細(xì)胞脂質(zhì)含量增加。目前，本研究尚還未完成干預(yù)實驗，棕櫚酸影響顆粒細(xì)胞的脂質(zhì)代謝還有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究以KGN 細(xì)胞為研究對象，采用棕櫚酸孵育，以膽固醇轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白SR-BI 為調(diào)控靶點，研究棕櫚酸對KGN 細(xì)胞脂質(zhì)流出的影響，并探討該過程潛在的調(diào)控機(jī)制，可望從新的視角闡明SR-BI 在卵巢顆粒細(xì)胞中的作用及可能機(jī)制，為靶向調(diào)控SR-BI，有效防治卵巢脂質(zhì)代謝障礙疾病。通過實驗發(fā)現(xiàn)棕櫚酸在卵巢中參與顆粒細(xì)胞能量代謝，并且在本研究中首次發(fā)現(xiàn)棕櫚酸能促進(jìn)KGN 細(xì)胞脂質(zhì)含量增加，此外，顆粒細(xì)胞膜上清道夫受體SR-BI 表達(dá)增加，以及過氧化物酶體增殖物激活受體PPARα增加。這些說明棕櫚酸可能通過SR-BI 影響顆粒細(xì)胞脂質(zhì)含量，其機(jī)制可能與PPARα有關(guān)。