索邦和西伯利亞百合的離體再生體系建立

崔均濤，劉鳳民，張偉麗

（1.仲愷農業(yè)工程學院園藝園林學院，廣東 廣州 510225；2.仲愷農業(yè)工程學院教學科研基地，廣東 廣州 510225；3.仲愷農業(yè)工程學院農業(yè)與生物學院，廣東 廣州 510225）

【研究意義】 索邦（Sorbonne）和西伯利亞（Siberia）百合均屬于東方百合雜種系，為百合中的名貴品種群，由于其花色豐富、氣味芳香而深受人們喜愛，成為近年國內外市場熱銷的花卉種類之一，栽培面積也日益增長，在切花生產中的地位也越來越重要。百合主要靠分球繁殖，繁殖系數(shù)低，傳統(tǒng)的鱗莖球繁殖方法繁殖速度緩慢，而離體培養(yǎng)繁殖速度快，有利于工廠化和規(guī)?；a[1]。利用組織培養(yǎng)技術，既能脫毒、又能加快其生長發(fā)育周期，從而更好地利用其經(jīng)濟價值和開發(fā)其潛力[2]?！厩叭搜芯窟M展】 近年來，國內學者對多種百合進行離體培養(yǎng)研究[3-8]，隨著東方百合在市場上越來越受歡迎，對東方百合的離體研究也逐漸增多[9-12]。龍彬等[13]研究表明，株洲紅東方百合的組培苗在-1 ℃條件下冷藏40 d為最佳并有助于煉苗成功。農艷豐等[14]研究了東方百合甜夢品種花器官的組織培養(yǎng)，結果表明花器官中子房最容易誘導愈傷組織，花柱、花藥次之，花托為最難誘導愈傷組織。目前東方百合的離體培養(yǎng)研究取得較大進展，如針對索邦，不同研究所報道的適宜培養(yǎng)基配方不同。梁芳等[15]認為，索邦百合最佳增殖培養(yǎng)基是MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，愈傷組織誘導最佳培養(yǎng)基是MS+IBA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，分化培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基是MS+NAA 0.3 mg/L+TDZ 0.1 mg/L+KT 0.2 mg/L；西伯利亞百合在MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L培養(yǎng)基中愈傷組織的誘導和增殖最佳，分化培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基是MS+IBA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L；以上兩個品種最佳生根培養(yǎng)基均為1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.01 mg/L。閆海霞等[16]研究表明，提伯（Tiber）、索邦和西伯利亞等3種東方百合愈傷誘導和分化的適宜培養(yǎng)基為MS，最適增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，最適生根培養(yǎng)基為MS+IBA 0.1 mg/L?！颈狙芯壳腥朦c】 目前東方百合的離體培養(yǎng)研究雖然取得較大進展，但是索邦、西伯利亞兩種東方百合遺傳轉化再生系統(tǒng)研究仍較少[17-18]。【擬解決的關鍵問題】 確定索邦和西伯利亞百合的離體再生系統(tǒng)適合的誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基以及最佳轉化受體系統(tǒng)，建立穩(wěn)定、高效的索邦和西伯利亞百合的離體再生體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為索邦百合和西伯利亞百合的無菌鱗莖球，購自中國芊卉種苗公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體滅菌 取百合鱗莖球先經(jīng)流水沖洗2 h，沖洗干凈后把鱗片葉剝下，選取分化能力最強、與鱗莖盤相連的下部柔嫩鱗片葉，剔除菌斑及瑕眥；用75%酒精浸泡30 s、無菌水漂洗后放入0.1% AgCl2（0.02%吐溫）中浸泡5～8 min，再用無菌水漂洗5次，濾紙吸干水分，切成3 mm×3 mm小塊作外植體，背面朝下接種在培養(yǎng)基上。在人工控制培養(yǎng)室中培養(yǎng)，先暗培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)溫度 22～26 ℃，光照度 2 000～2 200 Lx，光照12 h/d。

1.2.2 愈傷組織及芽誘導培養(yǎng)基篩選 以MS為培養(yǎng)基，共設置11個不同的激素濃度組合，包括2,4-D（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）+6-BA 0.2 mg/L、2,4-D（1.0、1.5、2.0 mg/L）、6-BA（2.0、1.5、1.0、0.5 mg/L）+NAA 0.2 mg/L。然后附加蔗糖3%、瓊脂0.55%～0.65%，pH調至5.8，培養(yǎng)120 d，觀察其生長狀況，60 d統(tǒng)計啟動率，120 d統(tǒng)計植株出芽頻率、有效外植體平均出芽數(shù)和出苗平均高度。

1.2.3 繼代增殖培養(yǎng)基篩選 接種60～90 d后誘導培養(yǎng)基中已長出大量愈傷組織和芽叢，將愈傷組織和叢芽切割成0.5 cm×0.5 cm小塊，接入附加有不同激素配比（包括2,4-D 1.5 mg/L、2,4-D 1.0 mg/L、6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L）的MS培養(yǎng)基上，定期觀察兩個品種在3個繼代培養(yǎng)基中的生長狀況，并統(tǒng)計芽增殖倍數(shù)、芽平均高度和生長勢。

1.2.4 根誘導培養(yǎng)基篩選 將苗高3 cm以上且基部鱗莖球達到直徑3 mm的無菌苗，移至附加不同激素配比（包括NAA 0.1、0.2、0.3 mg/L，IBA 0.1、0.2 mg/L）的1/2MS培養(yǎng)基中，40 d后統(tǒng)計生根數(shù)、根長和生長勢。

1.2.5 煉苗移栽 待苗基部鱗莖球發(fā)育至直徑達3 mm時，即可敞開瓶口在培養(yǎng)室中煉苗。1周后，用流動水清洗干凈根系上的培養(yǎng)基，移入噴灑過0.2%達克寧的基質（沙∶花肥∶椰糠為1∶1∶1）中，溫度為25 ℃，平均光照2 000 Lx，每天光照12 h，15 d后再移入花盆或大田中生長。

1.2.6 抗生素敏感實驗 在獲得最適合兩種百合誘導增殖生根培養(yǎng)基的基礎上，設5個卡那霉素濃度梯度（0、50、75、100、150 mg/L）。30 d后統(tǒng)計褐化率，觀察發(fā)芽表現(xiàn)，篩選轉化植株時卡那霉素的濃度。

2 結果與分析

2.1 不同激素配比對百合愈傷組織誘導的影響

百合鱗片塊接入培養(yǎng)基中約15 d左右，鱗片顏色由白色變成綠色，接種20 d時鱗片表面及切口處出現(xiàn)白色及淺綠色突起，即出現(xiàn)了黃綠色愈傷組織，主要集中在不定芽上。每個鱗片上有數(shù)個突起，接種40～45 d時突起部位長出綠色芽叢，且鱗片基部出現(xiàn)愈傷組織并逐漸增大，至接種70～80 d時芽叢繼續(xù)長高，而基部愈傷組織在生長的同時又出現(xiàn)新的芽點及芽叢。繼續(xù)培養(yǎng)至120 d，可確定培養(yǎng)基各階段的誘導及伸長芽的效率。

從表1可以看出，接種60 d時，索邦和西伯利亞在H4、H5、H11培養(yǎng)基上的啟動率均高于其他培養(yǎng)基，百合在各誘導培養(yǎng)基中的愈傷及芽生長情況見圖1。接種120 d 時，在H1～H3等3種培養(yǎng)基中，兩種百合的植株出芽頻率和有效外植體平均出芽數(shù)均相對較低，甚至出芽數(shù)為0。在H4培養(yǎng)基中，索邦百合雖然植株出芽頻率為100%，但其有效外植體平均出芽數(shù)較低。兩種百合的植株出芽頻率和有效外植體平均出芽數(shù)均相對較低，甚至出芽數(shù)為0。而H5、H6、H7培養(yǎng)基中百合的有效外植體出芽數(shù)均大于5且出芽頻率都為100%，表明單獨使用2,4-D效果更好。索邦在H5、H6培養(yǎng)基中長出鱗莖球，西伯利亞在H6、H7培養(yǎng)基中也長出鱗莖球。H11培養(yǎng)中，百合的各項測定指標均顯著高于H8、H9、H10、H11等4種培養(yǎng)基。綜上說明，索邦的最適芽誘導和伸長培養(yǎng)基是MS+2,4-D 1.0～2.0 mg/L、MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L，西伯利亞的最適芽誘導和伸長培養(yǎng)基為MS+2,4-D 1.0～1.5 mg/L、MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

表1 不同激素配比對百合愈傷組織誘導的影響Table 1 Effects of different hormone ratios on callus induction of Lilium

圖1 索邦和西伯利亞百合在不同誘導培養(yǎng)基中的愈傷組織及芽生長情況Fig.1 Callus and bud growth of Sorbonne and Siberia in different induction medium

2.2 不同激素配比對百合叢芽繼代增殖的影響

由表2可知，在MS+2,4-D 1.5 mg/L培養(yǎng)基中，索邦和西伯利亞百合的增殖倍數(shù)最高、分別為2.76和4.51，且芽平均高度也最高、分別為5.03和5.17，但兩種百合的長勢均比MS+6-BA 0.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基中植株差。西伯利亞百合在MS+2,4-D 1.5 mg/L培養(yǎng)基中雖然分化出大量愈傷組織，但芽有畸形現(xiàn)象。而在MS+6-BA 0.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基中，百合苗較壯且沒有畸形，芽與愈傷組織的密度也較合適。試驗中還發(fā)現(xiàn)，兩種百合培養(yǎng)一個周期后，西伯利亞百合在僅含有2,4-D的培養(yǎng)基中叢芽發(fā)生玻璃化現(xiàn)象，說明2,4-D對西伯利亞百合的抑制分化作用更明顯。綜合生長狀況，我們認為在MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L中，兩種百合繁殖出的愈傷組織和叢芽更健壯、密度也更合適。

表2 不同激素配比對百合叢芽繼代增殖的影響Table 2 Effects of different hormone ratio on subculture proliferation of Lilium cluster buds

2.3 不同激素配比對百合根誘導及移栽的影響

由表3可知，索邦和西伯利亞的根誘導培養(yǎng)基試驗結果比較一致，在添加NAA 0.1～0.3 mg/L的MS培養(yǎng)基中，MS+NAA 0.2 mg/L中百合的平均根長度顯著高于其他兩種培養(yǎng)基，索邦和西伯利亞分別為1.13、3.70，平均生根數(shù)次于MS+NAA 0.3 mg/L培養(yǎng)基，且植株生長勢好、根系粗壯。雖然MS+NAA 0.3 mg/L培養(yǎng)基中百合平均生根數(shù)最高，但是植株生長勢相對于其他兩種培養(yǎng)基較為弱。MS+IBA 0.1 mg/L培養(yǎng)基中百合的各項指標均顯著高于MS+IBA 0.2 mg/L，且植株生長勢好、根系粗壯。綜合生根數(shù)、平均根長度和植株生長勢，效果較好的生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.2 mg/L、1/2MS+IBA 0.2 mg/L，IBA和NAA對促進百合生根效果相仿。

表3 不同激素配比對百合根誘導及移栽的影響Table 3 Effects of different hormone ratios on the rooting induction and transplanting of Lilium

2.4 卡那霉素抗性篩選

從表4可以看出，隨著卡那霉素質量濃度的升高，兩種百合褐化率上升、發(fā)芽數(shù)減少，外植體的生長和分化受到不同程度的影響。當卡那霉素質量濃度較低時，兩種百合發(fā)芽正常，當卡那霉素質量濃度為150 mg/L時，兩種百合褐化率分別高達100%和98%，無芽發(fā)生且芽呈黑褐色?？梢?，卡那霉素質量濃度越高，兩種百合均表現(xiàn)為發(fā)芽減少并呈萎縮趨勢，150 mg/L濃度能起到抑制未轉化細胞的效果。

表4 百合鱗片對卡那霉素的抗性Table 4 Resistance of Lilium scales to Kanamycin

3 討論

3.1 不同激素配比對百合叢芽的影響

通過對索邦和西伯利亞百合離體快繁結果表明，在促進愈傷組織的誘導、繼代增殖、生根培養(yǎng)中，生長調節(jié)劑的選擇及其濃度都會影響芽的生長。同時發(fā)現(xiàn)索邦和西伯利亞在添加2,4-D的MS培養(yǎng)基中出芽效果更好，說明在適宜濃度下單獨使用2,4-D比組合使用6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L對百合叢芽持續(xù)生長的效果更明顯，但其綜合生長狀況卻不及組合激素發(fā)揮穩(wěn)定。因此，單獨使用2,4-D對百合分化芽的生長狀況比再加入6-BA強，這與前人試驗結果[19]相一致。在組合激素培養(yǎng)基中百合幼苗更加健壯，不易發(fā)生玻璃化現(xiàn)象。此外，本試驗還觀察到的6-BA在愈傷組織分裂中的作用，6-BA濃度過高（2.0 mg/L）會導致百合出苗長勢變差，相對適宜的6-BA濃度為0.5 mg/L。我們認為，6-BA和NAA在百合增殖和生根中的作用是協(xié)同的，任意一種濃度過高或過低后會導致植株生長不良，兩者比例合適時才能發(fā)揮最大效果。

3.2 百合轉基因研究、抗生素對百合的敏感影響

目前，采用農桿菌介導法進行百合轉基因研究中，大多采用的是在室外生長的鱗片葉進行消毒，然后與農桿菌共同培養(yǎng)[20]，此法的最大缺點是污染率高，表面消毒對供試材料具有一定傷害，從而造成褐化，最終導致轉化率降低。而本研究采用組織培養(yǎng)的方式，將鱗片葉直接作為基因轉化受體材料，建立直接分化再生系統(tǒng)，此法的優(yōu)勢在于取材不受季節(jié)和氣候的影響，且沒有外植體污染問題，從而提升了轉化效率。

唐東芹等[21]認為，在基因轉化過程中百合外植體不能連續(xù)被分割，且在篩選培養(yǎng)基時抗生素會使有切口的外植體褐化并導致死亡，因此要保證外植體的完整性。說明百合再生能力強且適合離體培養(yǎng)，若以鱗片為外植體，其直接分化率高、分化周期短且分化能力強，是外植體穩(wěn)定來源之一卡納霉素的使用能有效抑制非轉化細胞或細菌的生長，并且不影響轉化細胞的生長效果，但轉化篩選時必須保證外植體的完整性，防止傷口惡化。鱗片葉再生過程中，NAA和6-BA組合對鱗片葉再生效果好，且分化率高，可作為良好的受體。

4 結論

本研究以百合鱗莖片為外植體，比較了不同誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基的誘導、繼代增殖、生根效果。結果表明，索邦百合的最佳誘導培養(yǎng)基是MS+2，4-D 1.5～2.0 mg/L，西伯利亞百合是2，4-D 1.0～1.5 mg/L；兩種百合的最佳繼代培養(yǎng)基均為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L，最佳生根培養(yǎng)基均為1/2MS+NAA 0.2 mg/L、1/2MS+IBA 0.2 mg/L。以百合鱗莖片為受體系統(tǒng)而篩選轉化植物時，卡那霉素最佳質量濃度為150 mg/L。本研究確定了兩種百合的離體再生體系的技術參數(shù)，誘導培養(yǎng)開始7 d為暗培養(yǎng)，誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)60～90 d后，分割芽叢或新形成的小鱗莖片后接入繼代培養(yǎng)基中繼代45 d，再生根培養(yǎng)40～50 d，當芽苗高度達3 cm且新形成鱗莖球直徑達3 mm時，煉苗7 d，然后移至基質（沙∶花肥∶椰糠為1∶1∶1）生長15 d后移入花盆或大田中生長。本研究結果可為東方百合品種種球工廠化生產及遺傳轉化再生體系提供充實理論依據(jù)。