一株疑似野生大白口蘑的鑒定及菌絲培養(yǎng)基篩選

李文豪，劉 明，康林芝，肖自添，何煥清，徐 江，胡婷婷，劉 主

（1.韶關(guān)學(xué)院英東生命科學(xué)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣東 廣州 510640；3.韶關(guān)學(xué)院英東食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005）

【研究意義】 大白口蘑（Tricholoma giganteum）又稱為巨大口蘑、洛巴伊口蘑，是一種大型簇生的食、藥用真菌，隸屬于擔(dān)子菌門、傘菌綱、傘菌目、口蘑科、口蘑屬[1]。大白口蘑的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，其粗蛋白和多糖含量分別是115.9 g/kg和365.9 g/kg，含有18種氨基酸，其中人體必需氨基酸74.4 g/kg，滿足FAO/WHO最高蛋白質(zhì)的需求[2]。大白口蘑含有豐富的礦物質(zhì)元素，如鋅、鉀、鈣、鐵、鈉、鎂等[3]；還具有防突變、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗艾滋病毒、抗真菌、降血糖血脂血壓和保護(hù)肝臟等功能[4-9]。大白口蘑是一種簇生的野生珍稀食藥用菌，菇體肥大、菌肉鮮美、口感極佳，具有很高的食藥用價(jià)值，而且不易褐變和腐爛，耐貯運(yùn)性好，有很好的開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景[10]。大白口蘑屬于高溫品種，可在夏季市場(chǎng)短缺菇的情況下?lián)屨际袌?chǎng)，具有良好的發(fā)展前景[11]。韶關(guān)學(xué)院“食用菌生態(tài)循環(huán)栽培技術(shù)及產(chǎn)業(yè)化創(chuàng)新服務(wù)團(tuán)隊(duì)”在韶關(guān)學(xué)院校園內(nèi)的荒地雜草叢中（旁有苦楝樹和海南蒲桃樹）發(fā)現(xiàn) 1 株疑似大白口蘑野生菌。本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)特征與ITS序列分析鑒定其分類學(xué)地位，并篩選該菌株適宜的菌絲培養(yǎng)基，旨在豐富其種質(zhì)資源，也為其馴化、栽培和育種提供依據(jù)和參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】 大白口蘑是由法國(guó)真菌學(xué)家Hiem發(fā)現(xiàn)于非洲，于1970年定名，被稱為“菌中新秀”[12]。文獻(xiàn)報(bào)道了從不同地方分離純化得到的野生大白口蘑新品系：卯曉嵐[13]于1992年在香港中文大學(xué)校內(nèi)鳳凰木樹旁草地采集到 1 株；郭翠英等[14]在福建省熱帶植物研究所（廈門）、上官舟建等[15]在荊西地區(qū)、湯洪敏等[16]在云南楚雄、鄧優(yōu)錦等[17]在福建福州、黎金鋒等[18]在廣西南寧、張國(guó)廣等[19]在廈門大學(xué)、劉月廉等[20]在湛江海洋大學(xué)校園內(nèi)均采集到野生菌株，并進(jìn)行了分離鑒定和馴化等方面的研究。莫美華等[10]在廣州先后分離到 4 株大白口蘑新品系，分別命名為SCAUI、Dongguanzhuang、SCAU2和SCAU3，并對(duì)它們的生物學(xué)特性、栽培學(xué)特性和品質(zhì)特性等進(jìn)行了研究，經(jīng)過馴化及優(yōu)化栽培，獲得了4.5萬～7.5萬kg/hm2的產(chǎn)量，而且得到抗雜菌能力強(qiáng)的菌株?；洷本哂胸S富的野生大型真菌種質(zhì)資源，畢志樹等在粵北地區(qū)采集并鑒定包括擔(dān)子菌和子囊菌等大型真菌529種，其中野生食藥用菌113種[21]。據(jù)報(bào)道，目前粵北地區(qū)已知野生食藥用菌共有145種[22]，但沒有發(fā)現(xiàn)野生大白口蘑的文獻(xiàn)報(bào)道。大白口蘑的商業(yè)化栽培范圍較窄，大部分地區(qū)仍處于試栽培階段，生產(chǎn)規(guī)模較小，制約了該菌的大規(guī)模推廣[23]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】 本團(tuán)隊(duì)在粵北韶關(guān)學(xué)院校園內(nèi)中發(fā)現(xiàn) 1 株疑似大白口蘑野生菌株，旁有苦楝和海南蒲桃樹。采集并從子實(shí)體組織中分離純化得到純菌絲體，菌株命名為Tsg1。本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)特征與 ITS 序列分析進(jìn)行鑒定，并通過在PSA培養(yǎng)基、酵母膏培養(yǎng)基和棉籽殼培養(yǎng)基中的培養(yǎng)試驗(yàn)，篩選該菌株菌絲培養(yǎng)最合適的培養(yǎng)基?！緮M解決的關(guān)鍵問題】 通過ITS序列克隆和分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)，對(duì)野生菌株Tsg1進(jìn)行鑒定，豐富其生物種質(zhì)資源；并通過菌絲培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)和野生環(huán)境分析，為其開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 野生大白口蘑Tsg1，采自廣東韶關(guān)學(xué)院校園內(nèi)荒地雜草叢中，通過組織分離法分離培養(yǎng)得到純化的菌絲體。

1.1.2 試劑 PSA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1 L，自然pH。酵母膏培養(yǎng)基：麥芽糖26 g，酵母膏2 g，MgSO42.7 g，KH2PO41.8 g，維生素B 116 mg，瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1 L，自然pH。棉籽殼培養(yǎng)基：棉籽殼150 g，麩皮20 g，蒸餾水1 L，煮沸20 min，過濾；濾液中加葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，煮沸后蒸餾水定容至1 L，自然pH。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與選擇 菌株Tsg1的ITS序列PCR擴(kuò)增采用真菌ITS通用引物：ITS1，5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；ITS4，5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 野生菌株的采集和分離 2016年7月16日，在韶關(guān)學(xué)院西區(qū)的荒地上采集到 1 株野生大型真菌，采用食用菌組織分離法：取1塊黃豆大小的菌蓋與菌柄交界部位的菌肉接種于PSA固體培養(yǎng)基上，30 ℃下培養(yǎng)6 d，然后將得到的純菌絲體轉(zhuǎn)入PSA斜面培養(yǎng)基中，命名為Tsg1，備用。

1.2.2 野生菌株的鑒定 （1）形態(tài)觀察和鑒定。觀察野生菌株子實(shí)體的菌蓋、菌褶、菌柄、菌環(huán)和菌托等主要構(gòu)成部分，觀察菌絲體在固體培養(yǎng)基上菌落的形狀、大小、味道、顏色、生活力等，同時(shí)采用平板斜插蓋玻片法[24-25]觀測(cè)菌絲細(xì)胞大小、形態(tài)、鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)等。（2）ITS鑒定。采用FDEB法[26]提取Tsg1基因組DNA，ITS區(qū)序列PCR擴(kuò)增主要參考Ahlawat等[27]的方法。以真菌ITS通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增：10×buffer（無 Mg2+）5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.0 μL，ddH2O 33 μL，Primer（IST1，4）4 μL，dNTPs（各 2.5 mmol/L）2 μL，DNA 模板 3 μL，Taq 酶（5 U/μL）1 μL，總體積 50.0 μL。PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 45 s，退火56 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，以上共32個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

將PCR產(chǎn)物送交生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行正反序列測(cè)定。將該序列在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST，在DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索同源性高的序列進(jìn)行比對(duì)分析，并用MEGA 7.2軟件對(duì)Tsg1的ITS序列進(jìn)行NJ法聚類分析[28]。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析G含量、C含量、遺傳距離和遺傳進(jìn)化關(guān)系等[29]。

1.2.3 菌絲培養(yǎng)基的篩選 選取一管生長(zhǎng)良好的母種，活化后再進(jìn)行轉(zhuǎn)接。用接種鉤劃取一黃豆大小的菌塊，接入PSA培養(yǎng)基、酵母膏培養(yǎng)基和棉籽殼培養(yǎng)基中，30 ℃下培養(yǎng)12 d后，觀察測(cè)量菌絲的生長(zhǎng)速度、色澤、密度和爬壁能力等情況。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)觀察和鑒定

該野生蘑菇大型，簇生，初期為半球形或傘形，菌蓋厚，邊緣平滑內(nèi)卷；后期平展，表面光滑，棕白色，菌蓋直徑5.0～16.0 cm、厚1.9～6.1 cm，平滑或稍粗糙，微粘。菌肉白色至微棕色、厚實(shí)、堅(jiān)韌、嫩脆、有濃厚的蘑菇香味，傷不變色。菌褶白色至淺黃色，直生或彎生，稍密，初期窄后變寬。菌柄中生或偏生，基部往往連合成一叢，實(shí)心粗壯，圓柱或倒棒狀，長(zhǎng)10.0～25.0 cm、粗3.5～9.0 cm，棕白色，基部肥大略彎，無菌環(huán)與菌托（圖1）。孢子表面光滑，球圓或橢圓形，孢子印白色。

圖1 野生大白口蘑（Tsg1）子實(shí)體Fig.1 The fruiting bodies of wild Tricholoma giganteum

由圖2可知，在PSA平板中菌絲體呈白色，絮狀，氣生菌絲較多且較致密，但菌絲生長(zhǎng)較緩慢，菌絲體3 d后開始擴(kuò)展。顯微觀察顯示菌絲細(xì)胞有隔膜，無色透明，均一，分枝均勻，菌絲直徑2.5～4.0 μm，鎖狀聯(lián)合明顯。綜上所述，根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)特征，并參考《中國(guó)大型真菌》[30]，初步判斷Tsg1與大白口蘑相似，暫定為“擬野生大白口蘑”。

圖2 野生大白口蘑菌絲鎖狀聯(lián)合Fig.2 Clamp connection of wild Tricholoma giganteum （1 000×）

2.2 ITS序列分析與鑒定

采用真菌ITS通用引物ITS1和ITS4，對(duì)疑似野生大白口蘑菌株Tsg1基因組DNA的ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)（圖3）。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行正反序列測(cè)定。將獲得的正反向序列使用DNAStar軟件包中的SeqMan進(jìn)行拼接、編輯，獲得完整的ITS序列（序列長(zhǎng)度為650 bp，GenBank登記號(hào)為MK660795）。

通過NCBI在線BLAST N檢索，該序列與GenBank中報(bào)道的大白口蘑JX041888.1、JX068526.1、MK024240.1、MH053153.1、MG867660.1、JX193694.1、KY744346.1、KJ463732.1、JN006792.1、KJ463731.1等菌株序列相似性較高，其Ident約為90%，且E value為0。

通過軟件MEGA7.2分析Tsg1與GenBank中報(bào)道的大白口蘑（共25株）的GC含量，結(jié)果顯示GC含量在39.0～45.3之間，而Tsg1的GC含量較低，與HM120872.1極為相近、皆為41.8。選擇“Krima2-Paramenter”核酸距離模式進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，獲得遺傳距離矩陣（圖4）。顯示Tsg1與其他大白口蘑菌株之間的遺傳距離矩陣較小，有著很近的親緣關(guān)系。采用N-J（Neighbor-Joining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示Tsg1序列與GenBank中報(bào)道的大白口蘑（24株）序列具有較高的相似性、Ident在82.23%～90.06%之間，其中與序列JX041888.1相似性最高、Ident為90.06%，與序列KT154007.1相似性較低、Ident為82.23%。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定可確定Tsg1為大白口蘑新菌株。

圖3 ITS序列PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Result of ITS PCR amplification

2.3 菌絲培養(yǎng)基的篩選

Tsg1菌絲在3種培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)12 d，生長(zhǎng)情況如圖6（彩版見封三）和表1。圖6和表1顯示，Tsg1菌絲在3種培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，菌絲的長(zhǎng)勢(shì)存在明顯不同，其生長(zhǎng)速度表現(xiàn)為棉籽殼培養(yǎng)基＞酵母膏培養(yǎng)基＞PSA培養(yǎng)基，爬壁能力表現(xiàn)為棉籽殼培養(yǎng)基＞酵母膏培養(yǎng)基＝PSA培養(yǎng)基，菌絲濃密和粗壯度表現(xiàn)為棉籽殼培養(yǎng)基＞PSA培養(yǎng)基＞酵母膏培養(yǎng)基。其中在棉籽殼培養(yǎng)基中菌絲的生長(zhǎng)速度最快、長(zhǎng)勢(shì)最好，菌絲雪白，爬壁能力強(qiáng)，致密健壯。

圖4 大白口蘑的遺傳距離矩陣Fig.4 Genetic distance matrix of Tricholoma giganteum

圖5 新菌株Tsg1與其他大白口蘑的進(jìn)化樹Fig.5 The phylogenetic tree of new strain Tsg1 and Tricholoma giganteum related species

圖6 Tsg1在3種培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)情況Fig.6 The growth situation of Tsg1 in three mycelium culture media

圖6 Tsg1在3種培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)情況Fig.6 The growth situation of Tsg1 in three mycelium culture media

表1 Tsg1在3種培養(yǎng)基上菌絲的生長(zhǎng)情況Table 1 The mycelium growth situation of Tsg1 in three culture media

3 討論

對(duì)野生大型真菌種質(zhì)資源的收集、馴化是當(dāng)前科研工作的重點(diǎn)之一。然而，以往對(duì)野生大型真菌的鑒定大多依據(jù)形態(tài)學(xué)分類，由于這些依據(jù)指標(biāo)存在一定的主觀性，且有些特征會(huì)隨著生長(zhǎng)條件的改變而發(fā)生變化，這給傳統(tǒng)分類帶來了困難，特別是對(duì)于那些形態(tài)特征非常相近的種，更是難以準(zhǔn)確區(qū)分[31]。分子生物學(xué)的快速發(fā)展為野生真菌的鑒定提供了準(zhǔn)確而便捷的方法，采用分子方法進(jìn)行物種間的分類和鑒定，分析物種間的同源性，更加貼近生物的本原。目前關(guān)于真核微生物的鑒定，通常利用其高度保守區(qū)rDNA間隔轉(zhuǎn)錄區(qū)間（ITS）特征進(jìn)行鑒定[32]，因?yàn)閞DNA的ITS區(qū)同時(shí)具有保守區(qū)和多變區(qū)，在真菌系統(tǒng)發(fā)育分析以及物種鑒定方面，ITS序列也作為一個(gè)有效鑒定真菌種類的分子標(biāo)記而被廣泛采用[33]。18S、5.8S和28S的序列在進(jìn)化中趨于保守、種間變化少；然而，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和ITS2作為非編碼區(qū)，最終不加入成熟核糖體，受到的選擇壓力較小，進(jìn)化速度快且變異速度存在較大的種間差異，適合種及種以下水平的分類研究[34]。

本研究在形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上，通過ITS序列分析，結(jié)合GenBank已有的大白口蘑基因序列特征，最終確定Tsg1為大白口蘑。近年在香港、云南、廣東、湖南、福建等多個(gè)地方的夏秋季都發(fā)現(xiàn)了野生大白口蘑，在鳳凰木樹旁、羊蹄甲樹旁、榕樹下、竹林中的沃土或草地上叢生[14-20]。本次發(fā)現(xiàn)的野生大白口蘑是在苦楝和海南蒲桃樹旁的雜草中，地處粵北的韶關(guān)學(xué)院校園內(nèi)。ITS序列分析顯示，該菌株與其他發(fā)現(xiàn)的野生菌株存在一定差異，與莫美華等[10,35]在廣州發(fā)現(xiàn)的菌 株（JX041888.1、JX068526.1、JX068527.1和JX193694.1）較為相似，其Ident分別為90.06%、89.63%、89.47%和89.58%，這對(duì)豐富大白口蘑的野生資源具有積極意義，有利于對(duì)本地野生巨大口蘑資源的保護(hù)、開發(fā)和育種。同時(shí)，培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)顯示棉籽殼培養(yǎng)基是該菌株菌絲培養(yǎng)合適的培養(yǎng)基，這為后期相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究團(tuán)隊(duì)在粵北韶關(guān)學(xué)院內(nèi)苦楝和海南蒲桃樹旁的雜草中采集到1株疑似大白口蘑野生菌株，采用組織分離法，從野生子實(shí)體中分離純化得到純菌絲體。通過ITS序列克隆與序列分析，結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分析，鑒定該菌株為野生大白口蘑，命名為Tsg1。棉籽殼培養(yǎng)基是其菌絲培養(yǎng)適宜培養(yǎng)基。