母牦牛生殖系統(tǒng)中低氧誘導(dǎo)因子基因的表達(dá)分析

何向東 夏憶 吉格莫體 王會(huì) 字向東

（西南民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041）

低氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia inducible factor，HIF）是動(dòng)物低氧生理反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，由α和β亞基組成的異二聚體，其中α亞基受氧調(diào)節(jié)，是調(diào)節(jié)HIF活性的功能亞單位。目前已知的α亞基有HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α三種。在哺乳動(dòng)物處于低氧環(huán)境下，HIF-1α和HIF-2α因子的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和體內(nèi)轉(zhuǎn)錄潛力均顯著提高［1］，進(jìn)而調(diào)控HIF下游基因，特別是關(guān)于糖酵解相關(guān)基因（如GLUT1、LDHA和VEGF）表達(dá)，通過增加糖酵解效率、促進(jìn)血管生成和增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等途徑來維持其在缺氧環(huán)境中的生存和對(duì)抗缺氧損傷［2］。低氧分壓通過HIF-1α影響卵母細(xì)胞的成熟、黃體的形成與早期胚胎的發(fā)育［3］，但是，慢性低氧也會(huì)引起動(dòng)物繁殖能力下降［4］。HIF-2α又稱內(nèi)皮 PAS蛋白 1（EPAS-1），刺激胚胎分泌兒茶酚胺，調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育［5］。小鼠子宮缺失HIF-2α?xí)斐尚∈蟛辉胁挥?，而小鼠子宮缺失HIF-1α?xí)斐尚∈蠓敝衬芰ο陆担?］。雖然世居高原的動(dòng)物對(duì)高原低氧有一定的適應(yīng)能力，但雌性高原鼠兔（Ochotona curzoniae）的窩產(chǎn)仔數(shù)也隨著低氧程度的提高而下降［7］。目前，動(dòng)物繁殖機(jī)能對(duì)低氧環(huán)境適應(yīng)其分子調(diào)控機(jī)制的有待深入研究。

牦牛（Bos grunniens）是生活在青藏高原高海拔低氧地區(qū)的物種，是高原人民的主要生活資料和生產(chǎn)資料［8］。牦牛為季節(jié)性發(fā)情動(dòng)物，生殖系統(tǒng)發(fā)育緩慢，性成熟晚，繁殖性能低［9］。黃牛則主要分布在海拔2 000 m以下的地區(qū)，為常年發(fā)情動(dòng)物［10］。因此，本研究以母牦牛和母黃牛為研究對(duì)象，運(yùn)用RT-qPCR 技術(shù)對(duì)HIF-1αmRNA 與HIF-2αmRNA 在兩物種生殖軸的表達(dá)差異進(jìn)行分析，探討牦牛生殖機(jī)能對(duì)高原低氧環(huán)境的適應(yīng)調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 在2017年10月，實(shí)驗(yàn)選取5頭4-5歲紅原（海拔3 000 m）放牧飼養(yǎng)、處于卵泡期的健康母牦牛和5頭4-5歲巴中（海拔1 500 m）放牧飼養(yǎng)、處于卵泡期的健康母黃牛，于四川省成都市青白江唐家寺屠宰場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)屠宰。使用無菌剪刀剪取下丘腦、腦垂體、卵巢、輸卵管和子宮組織。組織樣用生理鹽水沖洗干凈，投入液氮罐，快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑、儀器 Trizol Reagent為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；DNA Marker DL2000，2×Taq PCR Master mix為上海天根公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit）為Thermo Scientific公司產(chǎn)品；DH5α感受態(tài)細(xì)胞為康迪生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；克隆載體pMD-19Vector、IPTG、X-Gal和氨芐青霉素均為大連寶TaKaRa生物工程有限公司產(chǎn)品；Green Supermix 為 DBI?BIOSCIENCE公司產(chǎn)品；DNA膠回收試劑盒（AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit）為北京Axygen公司產(chǎn)品；RT-qPCR儀（CFX6）為美國(guó)Bio Rad公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)（GEL DOC2000）為美國(guó)Bio Rad公司產(chǎn)品；PCR儀（ETC811）為蘇州東盛興業(yè)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI公布的牦牛HIF-1α（ 登 錄 號(hào) ：AY621118.1）、HIF-2α（ 登 錄號(hào)：KJ617390.1）和內(nèi)參基因GAPDH（登錄號(hào)：EU195062.1）設(shè)計(jì)熒光定量引物（表1），引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

表1 HIF-1α、HIF-2α和GAPDH熒光定量引物

1.2.2 總RNA提取和cDNA第一鏈合成 將分別采集的牦牛和黃牛下丘腦、腦垂體、卵巢、輸卵管和子宮組織各取0.5 g左右放入預(yù)先用液氮冷卻的研缽內(nèi)，用研磨棒將各組織研磨成白色粉末狀，采用Trizol法分別提取牦牛和黃牛的生殖軸的總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄前檢測(cè)RNA的濃度為100 ng/μL。cDNA合成采用Thermo Scientific試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄程序按照說明書進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄后，將得到的cDNA分別作為常規(guī)PCR和RT-qPCR模板，置于-20℃冰箱備用。

1.2.3 常規(guī)PCR檢測(cè)引物特異性 以牦牛和黃牛下丘腦cDNA為模板，利用常規(guī)PCR檢測(cè)HIF-1α、HIF-2α和GAPDH引物特異性。常規(guī)PCR反應(yīng)體系為 25 μL ：Taq 酶（5 U/μL）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上游引物（100 μmol/μL）各 1 μL，cDNA1 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性 30 s；退火30 s（溫度見表1）；72℃延伸30 s，循環(huán)39次；72℃終延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，將0.5 μL pMD-19Vector、4.5 μL純化回收產(chǎn)物和5 μL Solution于16℃金屬浴中反應(yīng)過夜，保證連接徹底。連接后的產(chǎn)物再轉(zhuǎn)化100 μL宿主菌E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過冰浴、熱激活等步驟后均勻涂布于含有0.1%的氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養(yǎng)基上，涂布至干后封口倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。在超凈工作臺(tái)中，用滅菌槍頭挑取白色單克隆菌落于含有Amp（濃度為0.1%）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 180 r/min。震蕩培養(yǎng)8 h至菌液渾濁。取1 μL菌液作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)及電泳檢測(cè)鑒定后，最后挑選含目的基因片段的陽(yáng)性單克隆菌液送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 制備標(biāo)準(zhǔn)品 將PCR產(chǎn)物做膠回收作為制備標(biāo)準(zhǔn)品的模板，回收步驟按說明書進(jìn)行，進(jìn)行倍比稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)品，方法參照［11］。

1.2.5 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 依次從稀釋5個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)品中各取2 μL作為cDNA模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系25 μL：cDNA 2 μL，上、下游引物各1.5 μL，SYBR Green Supermix 12.5 μL，ddH2O 7.5 μL。反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，退火30 s（溫度見表1），72℃延伸30 s，循環(huán)40次。

1.2.6 目的基因組織表達(dá)分析 設(shè)置qRT-PCR溫度梯度，以便確定最佳退火溫度和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案，檢測(cè)HIF-1α和HIF-2α mRNA分別在牦牛和黃牛的繁殖相關(guān)組織表達(dá)差異，反應(yīng)體系25 μL：酶12.5 μL，ddH2O 7.5 μL，上、下游引物各 1.5 μL，cDNA 2 μL，反應(yīng)程序和1.2.5一致。每個(gè)樣品作3個(gè)重復(fù)。熒光定量結(jié)果分析方法參照［12］。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）表示，采用One-way ANOVA和t-檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 牦牛和黃牛不同組織總RNA提取

提取的RNA經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，28S RNA和18S RNA條帶清晰可見。說明提取的總RNA完整性強(qiáng)，無降解；分光光度計(jì)測(cè)得樣品OD260/ OD280比值均在1.8-2.0之間，說明提取總RNA純度高。這兩者結(jié)果表明RNA均符合要求，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 常規(guī)PCR檢測(cè)引物特異性

取PCR產(chǎn)物10 μL加入上樣孔，110 V電泳30 min，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)束后，在瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)清晰觀察到在膠上173 bp和140 bp處均為單一條帶，說明引物的特異性好且與預(yù)期的片段長(zhǎng)度相符。將測(cè)序結(jié)果與NCBI公布的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果（圖1）表明，這6段序列與NCBI公布序列完全一致?？梢杂糜趯?shí)驗(yàn)后續(xù)工作。

圖1 HIF-1α、HIF-2α和GAPDH基因在黃牛和牦牛擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 RT-qPCR檢測(cè)目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率

以制備好的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，RT-qPCR自動(dòng)生成HIF-1α、HIF-2α和GAPDH基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知R2值（相關(guān)系數(shù)）均大于或等于0.998，計(jì)算擴(kuò)增效率［12］分別為2.02、1.98和1.98，滿足實(shí)驗(yàn)要求；優(yōu)化RT-qPCR后，各基因溶解曲線形成單峰（圖2），表明符合RT-qPCR要求?？梢杂糜趯?shí)驗(yàn)后續(xù)工作。

2.4 目的基因組織表達(dá)量分析

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果表明HIF-1αmRNA、HIF-2αmRNA在牦牛生殖軸均有表達(dá)，但在各個(gè)組織中存在較大差異。HIF-1αmRNA在牦牛輸卵管表達(dá)量最高，在下丘腦、腦垂體、卵巢和子宮相對(duì)表達(dá)量較低。HIF-1αmRNA在牦牛腦垂體、輸卵管表達(dá)量均極顯著高于黃牛（P＜0.01），而兩物種在下丘腦、子宮和卵巢的表達(dá)差異均不顯著（圖3）。HIF-2αmRNA在牦牛腦垂體表達(dá)量最高。HIF-2αmRNA在牦牛腦垂體表達(dá)量極顯著高于黃牛（P＜0.01），在輸卵管表達(dá)量顯著高于黃牛（P＜0.05），而兩物種在下丘腦、卵巢和子宮的表達(dá)差異均不顯著（圖4）。

圖2 HIF-1α、HIF-2α和GAPDH溶解曲線

圖3 HIF-1α mRNA在黃牛和牦牛不同組織的表達(dá)量

圖4 HIF-2α mRNA在黃牛和牦牛組織表達(dá)譜

3 討論

HIF是誘導(dǎo)低氧基因和修復(fù)細(xì)胞氧內(nèi)環(huán)境的核心調(diào)節(jié)因子，通過增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄水平參與缺氧反應(yīng)基因的調(diào)控，從而使機(jī)體對(duì)低氧刺激產(chǎn)生復(fù)雜反應(yīng)。HIF-1α 主要作為應(yīng)激性低氧調(diào)控因子來調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)，HIF-2α主要負(fù)責(zé)細(xì)胞的長(zhǎng)期性低氧適應(yīng)［13］。HIF能夠提高滋養(yǎng)細(xì)胞的耐氧能力，而滋養(yǎng)細(xì)胞利于侵襲子宮蛻膜［14］。HIF-1α與胎盤轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)，胚胎在子宮內(nèi)膜處于生理性缺氧狀態(tài)時(shí)，HIF對(duì)于胚胎發(fā)育期間的造血前體細(xì)胞增殖和存活，低氧條件下對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖及其在子宮著床有重要的調(diào)控作用［15］。然而，有研究表明在極度缺氧的狀況下，HIF-1α等分子的作用不足以緩沖低氧的損害，使滋養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重缺氧、微管骨架結(jié)構(gòu)改變和侵襲能力明顯下降，使侵襲子宮蛻膜層過淺，對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞有明顯的抑制作用［16］。在高海拔低氧條件下，高原綿羊黃體中HIF-1α和VEGF基因的表達(dá)量顯著升高，增加黃體血管分布，提高黃體功能，從而提高對(duì)低氧條件的適應(yīng)能力［17］。對(duì)牛的初始黃體和黃體顆粒細(xì)胞的研究證明，HIF通過PKA信號(hào)途徑調(diào)節(jié)黃體細(xì)胞的增殖和固醇類激素的生成［18］，以提高對(duì)高原低氧的適應(yīng)能力。但有研究表明長(zhǎng)時(shí)間生活在高海拔低氧的動(dòng)的繁殖能力都降低［7，17，19］。雌性動(dòng)物生殖活動(dòng)受到下丘腦-垂體-卵巢軸（Hypothalamus-pituitary-ovaries，HPO）調(diào)控，輸卵管是受精和早期卵裂的場(chǎng)所，而子宮是胚胎和胎兒發(fā)育的場(chǎng)所，因此，本研究采用RT-qPCR法檢測(cè)了HIF-1αmRNA和HIF-2αmRNA在高海拔低氧環(huán)境條件下生存的牦牛與低海拔條件下生存的黃牛的HPO、輸卵管和子宮組織的表達(dá)量差異，對(duì)揭示母牦牛生殖機(jī)能對(duì)高原低氧環(huán)境適應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)表明，HIF-1αmRNA在牦牛和黃牛下丘腦、腦垂體、輸卵管、卵巢和子宮中都有表達(dá)說明該基因無組織表達(dá)特異性［20］，同時(shí)HIF-2αmRNA在牦牛卵巢表達(dá)，但這與Xiong等［21］研究認(rèn)為該基因在卵巢中無表達(dá)研究結(jié)果不一致，推測(cè)可能是實(shí)驗(yàn)方法不同引起結(jié)果不同，也說明兩基因?qū)φ{(diào)節(jié)動(dòng)物繁殖機(jī)能有不可忽略的作用。HIF-1αmRNA在牦牛輸卵管表達(dá)量最高，輸卵管是哺乳動(dòng)物受精和早期胚胎發(fā)育的場(chǎng)所，推測(cè)牦牛輸卵管對(duì)低氧應(yīng)激敏感性極高。下丘腦和腦垂體影響動(dòng)物FSH（卵泡刺激素）和LH（促黃體素）的分泌，對(duì)動(dòng)物生殖活動(dòng)有重要的調(diào)節(jié)作用，有研究證明該基因在動(dòng)物處于低氧狀態(tài)下會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生FSH，促進(jìn)卵泡在低氧環(huán)境中成熟［22］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HIF-1αmRNA在牦牛腦垂體表達(dá)量極顯著高于黃牛（P＜0.01）且在牦牛下丘腦表達(dá)量最低，推測(cè)在牦牛處于低氧環(huán)境中，該基因可能引起牦牛較低的繁殖力。HIF-2αmRNA在牦牛腦垂體表達(dá)量極顯著高于黃牛（P＜0.01），表明低氧環(huán)境可能通過刺激牦牛腦垂體分泌相關(guān)激素調(diào)節(jié)促紅細(xì)胞生成素的合成和分泌，同時(shí)也會(huì)影響繁殖機(jī)能［23-25］。HIF-1α、HIF-2αmRNA 在牦牛的表達(dá)量均高于黃牛，而HIF對(duì)促性腺激素釋放激素、雌激素和促黃體素等生殖激素有促進(jìn)作用［26］，推測(cè)低氧誘導(dǎo)因子在牦牛處于低氧環(huán)境中對(duì)維持牦牛繁殖性能和調(diào)控牦牛繁殖相關(guān)激素有重要作用［26］。HIF-2α?xí)⑴c促紅細(xì)胞生成素的合成［23-25］，而該生成素會(huì)影響輸卵管中包括雌激素等多種激素的分泌［27］，本實(shí)驗(yàn)中HIF-2αmRNA在輸卵管表達(dá)量顯著高于黃牛（P＜0.05），推測(cè)該基因會(huì)通過促紅細(xì)胞生成素調(diào)控牦牛生殖激素的分泌，影響牦牛生殖活動(dòng)，然而，動(dòng)物長(zhǎng)期的HIF高水平對(duì)其生殖能力有不良影響［4］。另外，HIF-1α、HIF-2αmRNA 表達(dá)量均高于牦牛，說明HIF在缺氧的狀態(tài)下會(huì)比非缺氧狀態(tài)下更加活躍［28］，而這種活躍程度是否會(huì)造成兩物種的繁殖差異可做進(jìn)一步研究。另外，本研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α、HIF-2αmRNA在季節(jié)性發(fā)情的母牦牛與全年發(fā)情的黃牛在下丘腦、卵巢和子宮的表達(dá)差異均不顯著，然而，本實(shí)驗(yàn)的牦牛樣品均采自發(fā)情季節(jié)，因此，兩基因在牦牛季節(jié)性乏情期與發(fā)情季節(jié)的表達(dá)量差異可做進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

長(zhǎng)期處于低氧環(huán)境下的牦牛的腦垂體和輸卵管中HIF-1α、HIF-2αmRNA表達(dá)量高于黃牛，這可能是牦牛生殖機(jī)能對(duì)高原低氧環(huán)境適應(yīng)的重要調(diào)控機(jī)制。