張瑞雪,崔欣悅,馬勇,劉金虎,張子韜,谷瑞增,魏穎,*
(1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京 100015;2.北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心,北京 100015;3.寧夏光彩生物科技有限公司,寧夏 銀川 750004)
枸杞(Lycium chinense Mill)為茄科枸杞屬(Lycium Linn.)植物,其果實(shí)是一種“藥食同源”的功能保健性食品,也是一味常用的補(bǔ)肝益腎中藥,其色鮮紅,味酸甜[1]。枸杞在地球上約80 多種,在我國有7個(gè)種3個(gè)變種,主要分布于我國北部地區(qū)[2],尤其寧夏枸杞在我國寧夏地區(qū)已形成大規(guī)模種植。
現(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)枸杞中化學(xué)成分類型多樣[3],主要涉及生物堿類、黃酮類、萜類等化合物,此外,多糖及類胡蘿卜素衍生物也是枸杞中常見的成分?,F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)枸杞具有多種活性,包括抗氧化、抗腫瘤、抗炎、肝保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、抗微生物及輻射保護(hù)活性等。近年來,隨著人們對養(yǎng)生保健的重視,枸杞加工的研究越來越深入。傳統(tǒng)枸杞產(chǎn)品,如枸杞汁、枸杞醋和枸杞酒的工藝逐漸改進(jìn);枸杞多糖、黃酮和籽油提取產(chǎn)品,枸杞干制品和枸杞復(fù)合產(chǎn)品開發(fā)已成為枸杞加工業(yè)研究的熱點(diǎn)。
枸杞是著名的防衰老滋補(bǔ)品[4],被列為首選的延緩衰老食品之一[5],許多養(yǎng)生方劑中都有枸杞。目前,枸杞功能活性方面,較側(cè)重于提取物和多糖,對枸杞全果的利用研究鮮有報(bào)道。乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是存在于人類和動物體內(nèi)的天然有益腸道菌群,果蔬經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后,能夠延長果蔬的保質(zhì)期,改善新鮮蔬菜的感官特性,并且產(chǎn)生多種功能性物質(zhì)[6-7],如超氧化物歧化酶、還原性谷胱甘肽、阿魏酸等,提升其營養(yǎng)價(jià)值和功能活性。本文選用經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的枸杞全果發(fā)酵液,以細(xì)胞模型為基礎(chǔ),研究其抗氧化活性和免疫調(diào)節(jié)活性,為枸杞的功能評價(jià)、合理開發(fā)利用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)并提供理論依據(jù)。
枸杞發(fā)酵液原液(1 號~3 號):寧夏光彩生物科技有限公司(1 號)、臺灣大漢酵素有限公司(2 號)、日本萬田酵素有限公司(3 號);小鼠(Balb/c,6 周齡~8 周齡):北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司;偶氮二異丁脒鹽酸鹽[2,2'-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride,AAPH]、2’,7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(2’,7’-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)、刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)、脂多糖(lipopolysaccharides,LPS):sigma 公司;RPMI-1640 培養(yǎng)基:Hyclon 公司;胎牛血清:杭州四季青公司;胰蛋白酶和中性紅:Amresco 公司;臺盼藍(lán)、紅細(xì)胞裂解液、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)、NO 試劑盒、CCK-8 試劑盒:碧云天生物技術(shù)研究所;磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS):現(xiàn)用現(xiàn)配,裝瓶滅菌后待用。
Spectra MR 多功能酶標(biāo)儀:美國dynex;AC2-6S1生物安全柜:新加坡藝思高科技有限公司;HF90 CO2培養(yǎng)箱:上海力申科學(xué)儀器有限公司。
1.3.1 枸杞發(fā)酵液清除自由基的影響
1.3.1.1 樣品處理
樣品處理前,單細(xì)胞懸液以1.0×105個(gè)/mL 接于6孔板,每孔2 mL 細(xì)胞懸液。待24 h 后細(xì)胞單層貼壁,樣品溶于熒光染料處理細(xì)胞(2 mL/孔),同時(shí)設(shè)空白對照組和AAPH 組,每組設(shè)置6個(gè)平行樣本。培養(yǎng)箱37 ℃繼續(xù)孵育1 h 后,吸棄含有樣品的培養(yǎng)液,用PBS 緩沖液清洗細(xì)胞兩次,除空白對照組外,每孔加入800 μmol/L AAPH,繼續(xù)培養(yǎng) 30 min,MTT 法測定OD 值,計(jì)算細(xì)胞相對存活率。
1.3.1.2 活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)測定
以1.0×105個(gè)/mL 細(xì)胞密度接種 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔 2 mL,放置 37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。隨后小心吸走6 孔中的細(xì)胞上清液,用PBS 清洗一次。加入無血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基稀釋的枸杞發(fā)酵液和熒光染料DCFH-DA,終濃度為25 μmol/L 2 mL,于 37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 30 min,然后取出吸走上清液,用PBS 小心清洗3 次。最后加入抗氧損傷劑AAPH,置于流式細(xì)胞儀測定相對熒光值。細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力以ROS 相對產(chǎn)生率來表示。
1.3.2 枸杞發(fā)酵液對T/B 淋巴細(xì)胞增殖的影響
1.3.2.1 小鼠脾細(xì)胞懸液的制備
將小鼠(Balb/c)拉頸處死,于75 %乙醇中浸泡5 min 進(jìn)行消毒處理,無菌分離完整脾臟,用PBS 沖去浮血,剝除結(jié)締組織及脂肪成分。注射器吸取約5 mL PBS,輕輕插入脾內(nèi)吹出細(xì)胞,重復(fù)操作數(shù)次至脾外膜透明,剩余脾組織剪成大小1 mm3小塊,剪碎后置于小燒杯上的200 目不銹鋼濾網(wǎng)上,用注射器針芯研磨,PBS 液洗滌,收集沖洗液至離心管,1 200 r/min 離心5 min,棄上清液,加入3 mL 紅細(xì)胞裂解液,靜置2 min,加入 10 mL PBS 終止反應(yīng),離心(1 200 r/min,5 min)棄上清,用 PBS 液洗兩次,離心(1 200 r/min,5 min),用RPMI-1640 不完全培養(yǎng)基洗一次,離心(1 200 r/min,5 min),棄上清。加適量RPMI-1640 完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素和10 mmol/L Hepes)。調(diào)整細(xì)胞濃度至 2×106個(gè)細(xì)胞/mL,臺盼蘭染色檢測細(xì)胞存活率大于95%。
1.3.2.2 枸杞發(fā)酵液對脾淋巴細(xì)胞增殖的影響
將脾細(xì)胞懸液(2×106個(gè)細(xì)胞/mL)按 100 μL/孔加入到96 孔培養(yǎng)板中,再添加10 μL ConA/LPS(終濃度為 5 μg/mL)和不添加 ConA,10 μL 樣品溶液,設(shè)置對照組、模型組和樣品組,每組做6 次重復(fù),將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。
選用CCK-8 試劑盒反應(yīng)樣品對脾細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增殖能力,在490 nm 測定吸光值,結(jié)果分別用增殖率和刺激指數(shù)(SI)表示,計(jì)算如下:
1.3.3 枸杞發(fā)酵液對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的影響
1.3.3.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備
Balb/c 小鼠,于實(shí)驗(yàn)前3 d 腹腔注射1.5 mL4%肉湯淀粉溶液。拉頸處死小鼠,于無菌工作臺上將其腹部皮膚剝離,用一次性注射器向腹腔內(nèi)注入RPMI-1640 不完全培養(yǎng)液 4 mL,輕柔腹部 2 min~3 min,用一次性注射器取其腹部液體,反復(fù)2 次~3 次。1 200 r/min離心8 min 收集細(xì)胞,洗滌2 次,在倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),用含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度達(dá)1×106個(gè)/mL,加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔100 μL,將細(xì)胞培養(yǎng)板放入37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.5 h,吸棄上清,用預(yù)溫培養(yǎng)基洗去未貼壁細(xì)胞,再加入含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液,制備96 孔板巨噬細(xì)胞單層。
1.3.3.2 枸杞發(fā)酵液對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性的測定
模型組每孔加入 10 μLLPS(濃度 30 μg/mL),實(shí)驗(yàn)組加入LPS 與不同濃度的枸杞發(fā)酵液各10 μL/孔,每組各設(shè)6個(gè)復(fù)孔,于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
培養(yǎng)24 h 后,用預(yù)溫的無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次,每孔加入200 μL 預(yù)溫的0.1 %中性紅溶液,于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)1 h;傾去上清液,用預(yù)溫RPMI-1640 培養(yǎng)液清洗3 遍,洗去未被吞噬的中性紅;每孔加入200 μL 細(xì)胞溶解液(乙酸∶50%乙醇=1∶100,體積比),25 ℃下放置 2 h ~3 h,待細(xì)胞溶解后,用酶標(biāo)儀測定OD550值。吞噬指數(shù)(pinocytosis index,PI)計(jì)算如下:
1.3.3.3 枸杞發(fā)酵液對巨噬細(xì)胞NO 生成量的影響
小鼠腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)樣品24 h 干預(yù)后,收集上清液,依據(jù)NO 試劑盒說明書測定NO 生成量。
1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)表示,并采用組間t 檢驗(yàn),P < 0.05 具有顯著性差異。
細(xì)胞內(nèi)短時(shí)間ROS 水平的波動對于調(diào)節(jié)細(xì)胞功能具有重要的作用,但是如果細(xì)胞暴露在高劑量的或是持續(xù)性的ROS 中的時(shí)候,ROS 防御體系的能力不足以去應(yīng)對機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的ROS,此時(shí)ROS 動態(tài)平衡狀態(tài)被打破,即會導(dǎo)致氧化應(yīng)激狀態(tài)的形成。大量存在的非生理水平的ROS 除了擾亂細(xì)胞正常的信號通路外,還會和多種細(xì)胞結(jié)構(gòu)成份包括DNA、蛋白質(zhì)、脂類在內(nèi)的生物大分子發(fā)生反應(yīng),對機(jī)體產(chǎn)生一系列損害以致引發(fā)疾病[8]。
枸杞發(fā)酵汁處理HepG2 細(xì)胞后ROS 的測定結(jié)果見圖1。
圖1 枸杞發(fā)酵液緩解HepG2氧化應(yīng)激的作用Fig.1 The oxidative stress effect of Lycium chinense Mill fermentation liquid on HepG2 cells
由圖1可知,在稀釋倍數(shù)為102時(shí),1 號枸杞發(fā)酵液顯著(P<0.01)提升細(xì)胞對抗氧化應(yīng)激狀態(tài)的能力,ROS 相對產(chǎn)生率最低,為0.61,同時(shí)ROS 相對產(chǎn)生率與稀釋倍數(shù)呈U-型量效關(guān)系。2 號枸杞發(fā)酵液作用HepG2 細(xì)胞時(shí),其降低細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的能力減弱。由圖1可知,3 號枸杞發(fā)酵液作用效果優(yōu)于2 號,在稀釋倍數(shù)為102,ROS 相對產(chǎn)生率為0.67,具有極顯著(P<0.01)抗氧化能力,但作用能力比1 號枸杞發(fā)酵液弱。
圖2為小鼠脾細(xì)胞在不同濃度枸杞發(fā)酵液干預(yù)72 h 后,細(xì)胞增殖情況。
圖2 枸杞發(fā)酵液對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Impacts of Lycium chinense Mill fermentation liquid on the proliferation of mice splenocytes
從圖2可以看出,枸杞發(fā)酵液7個(gè)作用濃度均可明顯刺激小鼠脾細(xì)胞增殖,對靜止的淋巴細(xì)胞具有明顯的促進(jìn)作用,存在一定的絲裂原作用。在稀釋倍數(shù)為 102時(shí),1 號枸杞發(fā)酵液顯著(P<0.01)促進(jìn)脾細(xì)胞增殖,增殖率最大,為 1.58,明顯高于 2 號(1.38)和 3 號枸杞發(fā)酵液(1.37),同時(shí)脾細(xì)胞增殖能力與作用濃度呈倒U-型量效關(guān)系。
脾細(xì)胞在有絲分裂原如ConA、LPS 等的刺激下,其形態(tài)和代謝會發(fā)生一系列的改變,轉(zhuǎn)化為母細(xì)胞并分化增殖。其中ConA 刺激T 細(xì)胞增殖,LPS 刺激B 細(xì)胞增殖。因此根據(jù)非特異性促有絲分裂原激活T 和B細(xì)胞增殖反應(yīng)的程度,可推測T 和B 細(xì)胞識別特異性抗原增殖反應(yīng)。圖3和圖4分別為T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞在不同濃度枸杞發(fā)酵液干預(yù)72 h 后細(xì)胞增殖情況。
圖3 枸杞發(fā)酵液對Con A誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Impacts of Lycium chinense Mill fermentation liquid on the proliferation of T lymphocytes induced by Con A
圖4 枸杞發(fā)酵液對LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Impacts of Lycium chinense Mill fermentation liquid on the proliferation of B lymphocytes induced by LPS
由圖3得出:與模型組相比,在稀釋倍數(shù)為2、10和102濃度作用下,1 號枸杞發(fā)酵液對ConA 誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖具有顯著(P<0.01)促進(jìn)作用,在稀釋倍數(shù)為102濃度時(shí),SI 值高達(dá)1.3,而2 號枸杞發(fā)酵液只在稀釋倍數(shù)為102濃度時(shí)有明顯(P<0.01)促進(jìn)作用。3號枸杞發(fā)酵液在稀釋倍數(shù)較大時(shí)有促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞增值的作用。
由圖4得出:3 種枸杞發(fā)酵液對促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)的B 淋巴細(xì)胞增殖作用效果不明顯,在稀釋倍數(shù)為10、102和 103濃度作用下,1 號發(fā)酵液具有明顯(P<0.01)促進(jìn)增殖作用,其他兩種發(fā)酵液在所有濃度下幾乎沒有顯著促進(jìn)B 淋巴細(xì)胞增殖作用。
巨噬細(xì)胞攝入大分子和顆粒狀或細(xì)胞狀物質(zhì)時(shí)主要通過胞吞作用來完成。胞吞作用即指細(xì)胞膜接觸大分子或顆粒狀物質(zhì)后,即將其包圍形成小泡并吞入細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。選用吞噬中性紅能力來評價(jià)枸杞發(fā)酵液對巨噬細(xì)胞的吞噬能力的影響。枸杞發(fā)酵液對LPS 誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的影響見圖5。
圖5 枸杞發(fā)酵液對LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的影響Fig.5 Impacts of Lycium chinense Mill fermentation liquid on neutral red pinocytosis by LPS-stimulated mice peritoneal macrophages
在LPS 的刺激下,1 號枸杞發(fā)酵液稀釋倍數(shù)為102時(shí),對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力具有顯著(P<0.01)促進(jìn)作用,可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞入較大的固體或分子復(fù)合物,同時(shí)吞噬能力和濃度呈倒-U 型量效關(guān)系。2 號枸杞發(fā)酵液稀釋倍數(shù)為10 時(shí)、3 號枸杞發(fā)酵液在稀釋倍數(shù)為103時(shí)對巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力具有顯著(P<0.01)促進(jìn)作用。
激活的巨噬細(xì)胞利用L-精氨酸合成NO,增加巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性,發(fā)揮非特異性殺菌和殺傷腫瘤細(xì)胞的作用,以及通過多條途徑引起免疫聯(lián)鎖反應(yīng)[9]。因此,NO 合成是巨噬細(xì)胞被激活的重要標(biāo)志,可以使巨噬細(xì)胞發(fā)揮非特異性免疫作用,并參與炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)[10]。枸杞發(fā)酵液對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO 生成的影響如圖6,在7個(gè)作用濃度下枸杞發(fā)酵液均可以促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO 生成。1 號枸杞發(fā)酵液在稀釋倍數(shù)為103濃度時(shí),NO2-生成濃度最大,促進(jìn)NO的生成最明顯,同時(shí)NO 生成量和作用濃度呈倒-U 型量效關(guān)系。2 號和3 號枸杞發(fā)酵液均能促進(jìn)NO 的生成。
圖6 枸杞發(fā)酵液對體外小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO生成量的影響Fig.6 Impacts of Lycium chinense Mill fermentation liquid on in vitro NO production by mice peritoneal macrophages
當(dāng)機(jī)體存在大量的非生理水平的ROS 時(shí),除了擾亂細(xì)胞正常的信號通路外,還會和多種細(xì)胞結(jié)構(gòu)成份包括脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)、蛋白質(zhì)、脂類在內(nèi)的生物大分子發(fā)生反應(yīng),對機(jī)體產(chǎn)生一系列損害以致引發(fā)疾病。氧化應(yīng)激與多種疾病中包括動脈粥樣硬化、糖尿病、肺纖維化、肝硬化、神經(jīng)退行性疾病和關(guān)節(jié)炎有著密切的關(guān)系,是衰老的主要原因[8]。同時(shí),抗氧化劑可以使免疫系統(tǒng)保持活力,維持人體的穩(wěn)定狀態(tài)。
本研究表明:枸杞發(fā)酵液具有較好的清除細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的能力、促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖和提高LPS 誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力,這3 種不同來源的枸杞發(fā)酵液在稀釋倍數(shù)為10、102和103濃度時(shí)作用明顯,1 號產(chǎn)品的稀釋倍數(shù)為102濃度為后續(xù)相關(guān)試驗(yàn)研究具有借鑒意義。枸杞發(fā)酵液具有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)能力這可能與其含有豐富的有機(jī)酸、維生素和礦物質(zhì)有關(guān)。經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn),枸杞發(fā)酵液中含有23.07 g/L的有機(jī)酸,主要是乳酸、酒石酸和草酸等。枸杞中具有免疫調(diào)節(jié)的多糖類物質(zhì)經(jīng)發(fā)酵后分解為小分子糖類,更易于人體吸收利用,發(fā)揮功效作用。豐富的維生素、礦物質(zhì)、黃酮類,有機(jī)酸和糖醇類物質(zhì)協(xié)同發(fā)揮抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用,作用機(jī)理、量效關(guān)系和物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定需要進(jìn)一步的研究。