膿毒癥合并急性腎損傷患者外周血TLR4、HMGB1、MFG-E8表達(dá)水平及臨床意義

崔文娟 李亞紅 胡國鑫 劉健 張志坤 牟林 彭錦 陳巖 樊曉光 喬魯軍

東營市勝利油田中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（山東東營257000）

膿毒癥是一種由感染引起的嚴(yán)重威脅生命健康的臨床綜合征，約占重癥醫(yī)學(xué)科（ICU）患者的40%，急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是膿毒癥的常見并發(fā)癥，而膿毒癥中約40%的患者可發(fā)展成膿毒癥合并急性腎損傷（sepsis induced acute kidney injury，SIAKI），SIAKI病死率高達(dá)70%，且發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，患者預(yù)后不良［1］。有研究［2-3］發(fā)現(xiàn)Toll受體4（TLR4）所啟動(dòng)的炎癥信號(hào)通路在SIAKI發(fā)揮重要作用，而高遷移率族蛋白box-1（HMGB1）是一種促炎因子，參與膿毒癥疾病發(fā)展的過程，同時(shí)乳脂球表皮生長因子-8（MFG-E8）是一種抗炎因子，與多種疾病發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)，尤其與炎癥、損傷性疾病關(guān)系密切，最近有研究發(fā)現(xiàn)采用MFG-E8治療敗血癥引起的腎損傷能夠減輕腎組織損傷，可作為SIAKI治療的潛在藥物。而HMGB1能夠通過與TLR4結(jié)合激活MAPK、NFκB等信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥因子生成，放大炎癥級(jí)聯(lián)效應(yīng)，脂多糖能刺激巨噬細(xì)胞釋放大量HMGB1，HMGB1可抑制巨噬細(xì)胞吞噬作用，而MFG-E8由巨噬細(xì)胞合成分泌，能夠強(qiáng)化巨噬細(xì)胞吞噬作用，減少病理損傷，減輕炎癥反應(yīng)［4］。因此，本研究旨在探討SIAKI患者外周血TLR4、HMGB1、MFG-E8表達(dá)水平及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2015年6月至2017年8月本院ICU收治的110例膿毒癥患者進(jìn)行研究，其中膿毒癥合并急性腎損傷50例（SIAKI組），膿毒癥不伴急性腎損傷60例（非AKI組），同時(shí)選取同期健康體檢正常者50例（對(duì)照組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］以及 AKI診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］；（2）年齡＞18歲；（3）所有受試者自愿參與本研究，并簽署知情同意書；（4）經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）非膿毒癥引起的AKI患者；（2）合并慢性腎病及腎功能障礙者；（3）合并尿毒癥者（4）無尿患者；（5）長期服用免疫抑制類藥物者；（6）合并惡性腫瘤者；（7）孕婦或哺乳期婦女。SIAKI組男28例，女22例；年齡23～72歲，平均（57.13±9.26）歲；非AKI組男 38例，女22例；年齡24～74歲，平均（59.35±9.49）歲；對(duì)照組男 36例，女24例；年齡23～74歲，平均（58.82±9.82）歲；3組受試者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 樣本采集所有受試者入院24 h內(nèi)清晨空腹抽取外周靜脈血5 mL于離心管中，室溫靜置15 min，3 200 r/min離心10 min，吸取上層血清，置于-80℃冷凍保存待測。

1.3 檢測方法（1）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測外周血 TLR4、HMGB1、MFG-E8 水平，TLR4、MFG-E8試劑盒購自美國R＆D公司，HMGB1試劑盒由武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司提供，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。（2）臨床指標(biāo)檢測：全自動(dòng)生化分析儀檢測外周血中降鈣素原（PCT）、血紅蛋白（Hb）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、血肌酐、尿素、尿酸、腎小球?yàn)V過率（eGFR）、清蛋白變化情況，并記錄；（3）計(jì)算急性生理學(xué)與慢性健康情況評(píng)分系統(tǒng)Ⅱ（APACHEⅡ）：記錄入院24 h APACHEⅡ評(píng)分，最高分為評(píng)分最終值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用描述，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間變量比較采用單因素方差分析；采用pearson進(jìn)行相關(guān)性分析；采用Logistic回歸分析對(duì)影響SIAKI嚴(yán)重程度因素進(jìn)行分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同分組外周血TLR4、HMGB1、MFG-E8表達(dá)水平比較SIAKI組、非AKI組患者外周血TLR4、HMGB1表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），且SIAKI組高于非AKI組（P＜0.05），SIAKI組、非AKI組患者外周血MFG-E8表達(dá)水平低于對(duì)照組（P＜0.05），SIAKI組低于非AKI組（P＜0.05）。見表1。

表1 不同分組受試者外周血TLR4、HMGB1、MFG-E8表達(dá)水平比較Tab.1 Comparison of expression levels of TLR4，HMGB1 and MFGE8 in peripheral blood of different groups of subjects x±s

2.2 不同分組受試者臨床指標(biāo)比較SIAKI組患者CRP、PCT、血肌酐、尿素、尿酸及APACHEⅡ評(píng)分顯著高于非AKI組（P＜0.05），eGFR明顯低于非AKI組（P＜0.05），兩組Hb、清蛋白比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同分組受試者臨床指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of clinical indicators in different groups of subjects x±s

2.3 SIAKI患者外周血TLR4、HMGB1、MFG-E8表達(dá)水平與臨床指標(biāo)相關(guān)性SIAKI患者外周血TLR4水平與尿素、尿酸無相關(guān)性（P＞0.05），與CRP、PCT、血肌酐、eGFR、APACHEⅡ評(píng)分呈明顯正相關(guān)（P＜0.05）；HMGB1水平與尿素、尿酸無相關(guān)性（P＞0.05），與 CRP、PCT、血肌酐、eGFR、APACHEⅡ評(píng)分呈正相關(guān)（P＜0.05）；MFG-E8表達(dá)水平與CRP、尿素、尿酸無相關(guān)性（P＞0.05），與PCT、血肌酐、eGFR、APACHEⅡ評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見表3。

表3 SIAKI患者外周血TLR4、HMGB1、MFG-E8表達(dá)水平與臨床指標(biāo)相關(guān)性Tab.3 The correlation between the expression levels of TLR4，HMGB1 and MFG-E8 in peripheral blood of SIAKI patients and clinical indicators

2.4 Logistic回歸分析Logistic回歸分析結(jié)果顯示，CRP、PCT、血肌酐、eGFR、TLR4、HMGB1是SIAKI的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），MFG-E8是SIAKI保護(hù)因素（P＜0.05）。見表4。

3 討論

膿毒癥可引起全身嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，可發(fā)展為嚴(yán)重膿毒癥或膿毒癥休克，是AKI的主要病因，有研究［7］顯示，膿毒癥發(fā)病率以每年1.5%速度增長，預(yù)測至2020年，全球嚴(yán)重膿毒癥患者人數(shù)可增至到110萬例，而SIAKI患者將增至45萬例。SIAKI可加重患者其他器官損傷，引起多器官功能障礙綜合征發(fā)生，但目前臨床上還無SIAKI特效治療方法，且治療預(yù)后不良，因此，尋找SIAKI治療靶點(diǎn)及潛在生物標(biāo)記物具有重要臨床意義。

表4 影響SIAKI嚴(yán)重程度的Logistic回歸分析Tab.4 Logistic regression analysis of SIAKI severity

TLR4是Toll樣受體家族（TLRs）重要成員之一，TLRs介導(dǎo)的信號(hào)通路是連接固有免疫與獲得性免疫的橋梁。有研究［8］顯示，由細(xì)菌引起膿毒癥中革蘭氏陰性菌占45%～60%，而革蘭陰性菌細(xì)胞壁毒性成分脂多糖與下游蛋白結(jié)合的復(fù)合物能夠激活TLR4復(fù)合物受體，引起一系列炎癥反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄和釋放大量細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)，在介導(dǎo)膿毒癥炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。研究［9］發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者外周血TLR4表達(dá)水平升高，并與膿毒癥嚴(yán)重程度相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，SIAKI組、非AKI組患者外周血TLR4表達(dá)水平高于對(duì)照組，且SIAKI組高于非AKI組。說明SIAKI患者存在外周血TLR4表達(dá)水平普遍升高現(xiàn)象。HMGB1是多種疾病的晚期炎性遞質(zhì)，可使免疫活性細(xì)胞過表達(dá)促進(jìn)多種致炎因子釋放，加重機(jī)體炎癥反應(yīng)，與免疫性疾病、膿毒癥、心肌缺血、急性肺損傷等疾病的發(fā)生密切相關(guān)［10］。安曙光等［11］研究表明SIAKI患者在發(fā)病24 h內(nèi)血清HMGB1表示水平明顯升高，且與SIAKI預(yù)后密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，SIAKI組、非AKI組患者外周血HMGB1表達(dá)水平高于對(duì)照組，且SIAKI組高于非AKI組，這上述研究結(jié)果相似。表明SIAKI患者存在外周血HMGB1高表達(dá)現(xiàn)象。MFG-E8是一種糖蛋白，在多種組織器官中均有表達(dá)，具有凋亡清除作用，可在巨噬細(xì)胞與凋亡細(xì)胞間發(fā)揮橋梁作用，維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)，MFG-E8同時(shí)還有修復(fù)損傷組織，減輕炎癥反應(yīng)作用。AZIZ等［12］研究表明通過直接脂多糖滴注建立的小鼠膿毒癥合并急性肺損傷模型中MFG-E8表達(dá)量顯著下調(diào)。本研究結(jié)果顯示，SIAKI組、非AKI組患者外周血MFG-E8表達(dá)水平低于對(duì)照組，SIAKI組低于非AKI組，表明SIAKI患者存在MFG-E8表達(dá)水平降低現(xiàn)象，即免疫調(diào)節(jié)失調(diào)現(xiàn)象。通過臨床指標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn)，SIAKI組患者CRP、PCT、血肌酐、尿素、尿酸及APACHEⅡ評(píng)分顯著高于非AKI組，eGFR明顯低于非AKI組，說明SIAKI患者存在嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)及腎組織損傷現(xiàn)象。CRP是炎性標(biāo)記物，能夠激活巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)釋放多種炎癥細(xì)胞因子，加重炎癥反應(yīng)，而血肌酐是腎損傷的檢測的重要指標(biāo)，APACHEⅡ評(píng)分是目前全球范圍內(nèi)ICU廣泛應(yīng)用的疾病嚴(yán)重程度評(píng)分系統(tǒng)，可直接反應(yīng)患者疾病的嚴(yán)重程度。經(jīng)相關(guān)性分析顯示，SIAKI患者外周血TLR4、HMGB1水平與CRP、PCT、血肌酐、eGFR、APACHEⅡ評(píng)分呈明顯正相關(guān)，MFG-E8表達(dá)水平與PCT、血肌酐、eGFR、APACHEⅡ評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，說明TLR4、HMGB1、MFG-E8表達(dá)水平與SIAKI患者炎癥反應(yīng)及嚴(yán)重程度關(guān)系密切?？赡苁怯捎赥LR4的免疫細(xì)胞激活誘導(dǎo)炎性細(xì)胞釋放炎癥因子，直接或間接加重腎損傷，而HMGB1釋放入血后能夠與TLR4的復(fù)合物受體結(jié)合進(jìn)一步加重腎損傷程度，同時(shí)HMGB1還能增加腎缺血-再灌注損傷，促進(jìn)腎小管細(xì)胞凋亡及加重嚴(yán)重反應(yīng)的作用，而MFG-E8在正常情況下發(fā)揮維持免疫穩(wěn)態(tài)作用，而SIAKI嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和腎損傷使MFG-E8水平降低，破壞了機(jī)體免疫平衡，患者出現(xiàn)免疫紊亂，也可加重患者腎損傷［13］。通過Logistic回歸分析顯示，CRP、PCT、血肌酐、eGFR、TLR4、HMGB1是影響SIAKI嚴(yán)重程度的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），MFG-E8是影響SIAKI嚴(yán)重程度的保護(hù)因素，表明臨床可通過對(duì)外周血TLR4、HMGB1、MFG-E8表達(dá)水平檢測鑒別SIAKI嚴(yán)重程度。

綜上所述，本研究通過對(duì)SIAKI患者外周血TLR4、HMGB1、MFG-E8表達(dá)水平檢測發(fā)現(xiàn)，SIAKI患者普遍存在外周血TLR4、HMGB1水平升高，MFG-E8水平降低現(xiàn)象，且與腎功能指標(biāo)具有一定相關(guān)性，并與SIAKI嚴(yán)重程度有關(guān)，可能參與SIAKI病程發(fā)生發(fā)展的過程，同時(shí)可作為SIAKI疾病嚴(yán)重程度的檢測指標(biāo)。