IL-2、IL-21 誘導(dǎo)人外周血單個核細胞及其抗腫瘤作用

吳育羅 涂海旋 官哲

隨著生物技術(shù)不斷發(fā)展, 特別是細胞技術(shù)的進步, 使腫瘤過繼性細胞免疫治療成為手術(shù)、化療、放療后惡性腫瘤的第四種治療手段［1］。既往的研究與臨床實踐顯示, 腫瘤過繼性細胞免疫治療應(yīng)該是一種比較理想、療效良好的腫瘤治療手段, 然而目前在臨床應(yīng)用上的療效并不能讓醫(yī)師及患者滿意, 仍存在細胞活性差、抗瘤譜局限的缺點［2-4］。利用細胞因子之間的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)機制, 協(xié)同增強彼此的生物學(xué)功能,有望進一步提高腫瘤過繼性細胞免疫治療的臨床療效。本研究探討了IL-2、IL-21 誘導(dǎo)人外周血單個核細胞及其抗腫瘤作用, 現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源 在2017年9月~2018年2月抽取正常健康人的外周血, 并應(yīng)用Ficoll密度梯度法分離PBMC, 制作成細胞懸液(1×106/ml), 并分為對照組、IL-2 組、IL-21 組和聯(lián)合組。對照組加入0.1 ml生理鹽水, IL-2組加入100 IU /ml的IL-2, IL-21組加入100 IU/ml的IL-21, 聯(lián)合組加入IL-2、IL-21各50 IU/ml。四組均放置在37℃并在含有5% CO2的孵箱中培養(yǎng), 共培養(yǎng)4 d。

1.2 方法

1.2.1 PBMC活細胞計數(shù) 在培養(yǎng)第4天后收獲PBMC, 在倒置顯微鏡下觀察, 并計算活細胞, 連續(xù)3次, 取平均值。

1.2.2 PBMC表型測定 應(yīng)用PBS洗滌各組PBMC, 分別加入PE-CD56與FITC-CD3, 在4℃環(huán)境下避光染色30 min, 并連續(xù)使用PBS洗滌2次, 然后使用流式細胞儀檢測四組的CD3-/CD56+、CD3+/CD56+水平。

1.2.3 腫瘤細胞殺傷率測定 使用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)測定, 取培養(yǎng)4 d的PBMC作為效應(yīng)細胞(E), 以對數(shù)生長期的4種腫瘤細胞作為靶細胞(T), 稀釋靶細胞5×103/孔,效靶比例(E∶T)為20∶1, 然后計算腫瘤細胞殺傷率。

1.3 觀察指標 比較四組的活細胞計數(shù)、CD3-/CD56+、CD3+/CD56+水平以及腫瘤細胞殺傷率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示, 采用t 檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組活細胞計數(shù)比較 聯(lián)合組、IL-2組、IL-21組、對照組的活細胞計數(shù)分別為(0.02±0.01)、(0.31±0.05)、(0.42±0.06)、(0.69±0.08), 聯(lián)合組、IL-2組、IL-21組活細胞計數(shù)均明顯高于對照組, 聯(lián)合組的活細胞計數(shù)明顯高于IL-2組、IL-21組, 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 四組CD3-/CD56+、CD3+/CD56+水平比較 聯(lián)合組、IL-2組、IL-21組的CD3-/CD56+、CD3+/CD56+水平均高于對照組, 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 四組CD3-/CD56+、CD3+/CD56+水平

表1 四組CD3-/CD56+、CD3+/CD56+水平

注：與對照組比較, aP＜0.05

組別 CD3-/CD56+ CD3+/CD56+IL-2組 20.61±3.98a 3.08±1.68a IL-21組 18.23±3.99a 3.02±1.61a聯(lián)合組 25.77±4.89a 5.72±1.98a對照組 10.11±3.01 1.02±0.60

2.3 四組腫瘤細胞殺傷率比較 聯(lián)合組對人胃癌細胞系M85、胃癌細胞系BGC823、結(jié)腸癌細胞系HCT116、結(jié)直腸腺癌細胞系HCT8的殺傷率分別為41.0%、40.0%、19.0%、16.0%, 均明顯高于IL-2組、IL-21組及對照組, 且IL-2組、IL-21組的腫瘤細胞殺傷率均明顯高于對照組, 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 四組腫瘤細胞殺傷率比較(%)

3 討論

IL-21 是IL-2 細胞因子家族的新成員, 主要是由活化CD4+T 細胞分泌出來的, 在B 細胞、T 細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)以及單核來源的樹突狀細胞(DC 細胞)上都能夠發(fā)現(xiàn)其受體。IL-21 是一種多效因子, 但是對人體免疫細胞活化的影響目前還未可知, 因此在探討IL-21 對于PBMC 的誘導(dǎo)作用以及對腫瘤的殺傷性是非常有必要的。

大量研究顯示, 多種細胞因子的聯(lián)合應(yīng)用是能夠減低單一細胞因子用量, 多種細胞因子與淋巴細胞之間通過存在的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)機制誘導(dǎo)培養(yǎng)細胞, 可以提高腫瘤過繼性免疫治療的療效［5,6］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn), IL-2、IL-21 都能夠增強人體NK 和細胞毒性T 淋巴細胞(CTL 細胞)功能［7］。有研究顯示, 黑素瘤小鼠在應(yīng)用過繼性T 細胞移植之后, DC 細胞上的黑素瘤接受疫苗后在應(yīng)用IL-2、IL-21 聯(lián)合治療, 相較于IL-2、IL-21 單獨使用治療, 聯(lián)合治療的療效比較顯著, T 細胞的應(yīng)答比較好, 抗腫瘤的活性比較持久［8］。IL-2、IL-21聯(lián)合使用能夠?qū)K 細胞分化成一種成熟的細胞, 以促進穿孔素的表達, 從而讓NK 細胞出現(xiàn)脫?；蛟鰪娂毎芙庑缘哪芰?。本研究發(fā)現(xiàn), IL-2、IL-21 聯(lián)合使用對NK 和CTL 細胞是能夠產(chǎn)生誘導(dǎo)激活作用的。IL-21 能夠在影響NK 細胞的同時, 通過NK 細胞內(nèi)的胞膜分子形成胞內(nèi)分子的表達從而調(diào)節(jié)NK 細胞的活性。人體試驗與小鼠試驗結(jié)果是不一樣的, IL-2、IL-21 必須聯(lián)合使用才能夠有效地維持人體的NK細胞存活, 并能夠有效上調(diào)各種分子的表達。

從表2 可以看出, IL-2、IL-21 聯(lián)合使用不僅可以激活NK 和CTL 細胞, 還可以發(fā)揮特異性的抗腫瘤效應(yīng), 對于人體胃癌細胞的殺傷力明顯比結(jié)腸癌細胞以及結(jié)直腸癌細胞的殺傷力更強?？梢酝茰y, 這種抗腫瘤的類型以及功能上的差異和腫瘤細胞表達分子是有一定關(guān)聯(lián)的。免疫系統(tǒng)對于腫瘤的殺傷力是建立在免疫能夠識別的基礎(chǔ)上, 因此在腫瘤免疫中, 細胞的免疫學(xué)特性是非常重要的。但是因為腫瘤免疫學(xué)特性的多樣性, 因此必須根據(jù)腫瘤細胞免疫學(xué)特征制定相應(yīng)的治療方案, 才能夠有效地提高免疫治療的抗腫瘤作用。

綜上所述, IL-2、IL-21 聯(lián)合使用能夠誘導(dǎo)人的PBMC,且抗腫瘤作用比較顯著, 值得在臨床推廣。