何氏養(yǎng)腎方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

莫美紅 劉仔

本文對(duì)何氏養(yǎng)腎方顆粒進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究, 對(duì)黃芪、生地黃進(jìn)行薄層鑒定, 黃芪為君藥, 具有補(bǔ)氣健脾、升陽(yáng)舉陷等效果, 其有效成分為黃芪甲苷；配以生地黃有脾腎共補(bǔ)、攝陽(yáng)歸陰之效, 梓醇為生地黃的有效成分。何氏養(yǎng)腎方湯劑具有較好的臨床治療效果, 但湯劑在服用、攜帶等方面不方便。因此, 本研究采用噴霧干燥、濕法制粒等制藥技術(shù)改進(jìn)為顆粒制劑。為保證其治療效果, 本研究選用HPLC 對(duì)何氏養(yǎng)腎方中的有效成分進(jìn)行定量測(cè)定, 具有控制何氏養(yǎng)腎方顆粒質(zhì)量的作用。

1 材料

圖1 黃芪薄層色譜圖

采用美國(guó)安捷倫公司1100 系列高效液相色譜儀, 色譜柱為Kromasil C18, 水純化系統(tǒng)購(gòu)自Millipore 公司, 電子天平材2 g, 同法制成對(duì)照溶液。薄層色譜法(中國(guó)藥典2015版通則0502)試驗(yàn), 吸取兩種溶液各10 μl, 分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上, 以三氯甲烷-甲醇(10∶1)為展開(kāi)劑, 展開(kāi), 取出,晾干, 置氨蒸氣中熏后, 置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.1.2 生地黃鑒別［2］取本品5 g, 加80%甲醇50 ml, 超聲處理30 min, 過(guò)濾蒸干濾液, 殘?jiān)铀? ml溶解, 飽和正丁醇購(gòu)自梅特勒-托利多公司的MS105DU 型。生地梓醇(批號(hào)110808-201210)、黃芪甲苷(批號(hào)110781-201314)對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。乙腈為色譜純, 水為超純水,其他試劑均為分析純。何氏養(yǎng)腎方顆粒自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

圖2 生地黃薄層色譜圖

2.1.1 黃芪鑒別［1］取本品5 g, 加乙醇30 ml, 加熱回流20 min, 過(guò)濾濾液蒸干, 殘?jiān)?.3%氫氧化鈉溶液15 ml溶解, 濾過(guò), 濾液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值5~6, 乙酸乙酯15 ml提取,分取乙酸乙酯液, 用無(wú)水硫酸鈉的濾紙濾過(guò), 濾液蒸干。殘?jiān)右宜嵋阴? ml溶解, 作為供試品溶液。另取黃芪對(duì)照藥振搖4次, 10 ml/次, 合并正丁醇液, 蒸干, 殘?jiān)蛹状? ml溶解, 作為供試品溶液。另取地黃對(duì)照藥材1 g, 同法制成對(duì)照藥材溶液。薄層色譜法(中國(guó)藥典2015版通則0502)試驗(yàn), 吸取兩種溶液各5 μl, 分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上, 以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(16∶0.5∶2)為展開(kāi)劑, 展開(kāi), 取出,晾干, 用0.1%的2, 2-二苯基-1-苦肼基無(wú)水乙醇溶液浸板,晾干。結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 黃芪甲苷 HPLC(中國(guó)藥典2015版通則0512)測(cè)定。十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水(32∶63)為流動(dòng)相；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)。理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)≥4000［3-5］。

2.2.2 生地梓醇 HPLC(中國(guó)藥典2015版通則0512)測(cè)定。十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.1%磷酸溶液(1∶99)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。理論板數(shù)按生地梓醇峰計(jì)算應(yīng)≥5000［6-8］。

2.2.3 對(duì)照品溶液制備 ①黃芪甲苷：取對(duì)照品精密稱定,加甲醇制成每1 ml含0.5 mg溶液；②生地梓醇：取對(duì)照品精密稱定, 加流動(dòng)相制成每1 ml含10 μg的溶液。

2.2.4 供試品溶液制備 ①黃芪甲苷：精密取6.0 g, 置索氏提取器中, 加甲醇40 ml, 冷浸過(guò)夜, 再加甲醇加熱回流4 h,提取液回收并濃縮至干, 殘?jiān)铀?0 ml, 微熱溶解, 飽和正丁醇提取4次, 40 ml/次, 合并正丁醇液, 氨試液洗滌2次,40 ml/次, 棄去氨液, 正丁醇液蒸干, 殘?jiān)铀? ml溶解, 放冷, D101型大孔吸附樹(shù)脂柱(內(nèi)徑為1.5 cm, 柱高為12 cm),水50 ml洗脫, 棄去水液, 再用40%乙醇30 ml洗脫, 棄去洗脫液, 繼用70%乙醇80 ml洗脫, 收集洗脫液, 蒸干, 殘?jiān)蛹状既芙? 轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶中, 加甲醇至刻度, 搖勻, 即得。②生地梓醇：精密取1.8 g, 置具塞錐形瓶中, 加甲醇50 ml,稱定重量, 加熱提取1.5 h, 放冷, 再稱定重量, 用甲醇補(bǔ)足重量, 搖勻, 濾過(guò), 精密量取續(xù)濾液10 ml, 濃縮至近干, 殘?jiān)鲃?dòng)相溶解, 轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中, 用流動(dòng)相稀釋至刻度, 搖勻,濾過(guò), 取續(xù)濾液, 即得［9-11］。

2.2.5 陰性對(duì)照溶液制備 按處方比例及制法, 制成缺黃芪、生地黃的陰性對(duì)照樣品；按供試品溶液的制備方法, 制成缺黃芪、生地黃的陰性對(duì)照溶液。

2.2.6 專屬性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品、供試品及陰性供試品進(jìn)行分析。結(jié)果見(jiàn)圖3~8。

圖3 黃芪甲苷對(duì)照品色譜圖

圖4 黃芪供試品色譜圖

圖5 黃芪陰性對(duì)照品色譜圖

圖6 生地梓醇對(duì)照品色譜圖

圖7 生地梓醇供試品色譜圖

圖8 生地梓醇陰性對(duì)照品色譜圖

2.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精確取混合對(duì)照品2.5 ml, 置入5 ml容量瓶中, 加甲醇定容, 則黃芪甲苷及生地梓醇質(zhì)量濃度為0.56、0.06 g/L, 在精確吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml, 置入1 ml容量瓶中加入甲醇定容, 再精確吸取試劑10 μl, 進(jìn)行HPLC測(cè)定。則黃芪甲苷線性方程為Y=1.586X+1.897(r=0.9995), 質(zhì)量濃度在0.1119~1.1119 g/L具有良好的線性相關(guān)；生地梓醇線性方程為Y=160947X+0.4438(r=0.9997), 質(zhì)量濃度在0.0119~1.1190 g/L具有良好的線性相關(guān)。

2.2.8 精密度試驗(yàn) 精確取對(duì)照溶液, 均分6份, 用HPLC測(cè)定, 得黃芪甲苷、生地梓醇峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.9%、0.7%, 說(shuō)明HPLC精密度較好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精確取供試品, 室溫0、2、4、6、8、12 h后測(cè)定黃芪甲苷、生地梓醇RSD為0.02%、1.60%, 則常溫條件12 h內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.2.10 重復(fù)性試驗(yàn) 精確取何氏養(yǎng)腎方6份, 在2.2.3條件下行平行測(cè)試, 檢測(cè)含量。結(jié)果表明該樣品中黃芪甲苷、生地梓醇藥量為1.25、0.0158 mg/L, RSD為2.3%、1.2%, 則表明HPLC具有較好的重復(fù)性。

2.2.11 加樣回收率試驗(yàn) 精確稱量1.9 g本品置于具塞錐形瓶中, 分為9份, 加入黃芪甲苷2.32 g/L溶液0.8、1.0、1.2各2份, 依據(jù)供試品溶液方法配置樣品, 并按照2.2.1條件下HPLC進(jìn)樣10 μl, 計(jì)算加樣回收率?；厥章势骄禐?8.53%,RSD均值為2.1%。精確稱量1.9 g本品置于具塞錐形瓶中,分為9份, 加入梓醇0.0304 g/L溶液0.8、1.0、1.2各2份,依據(jù)供試品溶液方法配置樣品, 并按照2.2.1條件下HPLC進(jìn)樣10 μl, 計(jì)算加樣回收率。回收率平均值為97.78%, RSD均值為2.0%。

2.2.12 樣品含量測(cè)定 ①取三批次何氏養(yǎng)腎方顆粒樣品制得供試品溶液, 分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μL, 注入液相色譜儀測(cè)定。結(jié)果為3次黃芪甲苷含量分別為1.2634、1.2871及1.2341 mg/g, 平均含量為1.26151 mg/g。②取三批次何氏養(yǎng)腎方顆粒樣品制得供試品溶液, 分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μl, 注入液相色譜儀測(cè)定。結(jié)果為3次生地梓醇含量分別為0.3074、0.2995及0.3036 mg/g,平均含量為0.3035 mg/g。

3 小結(jié)

本研究采用TLC 對(duì)何氏養(yǎng)腎方中的黃芪、生地黃等藥材進(jìn)行鑒定, 采用HPLC 對(duì)制劑中的黃芪甲苷、生地梓醇含量進(jìn)行測(cè)定, 該方法經(jīng)過(guò)多批次的檢驗(yàn), 結(jié)果具有較好的重復(fù)性, 則該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究方法具有可行性, 能夠有效地保證何氏養(yǎng)腎方顆粒制劑的質(zhì)量, 對(duì)臨床治療效果的保障具有重要意義［12-14］。且本研究所選取的顆粒劑型為傳統(tǒng)制劑, 在未來(lái)的研究中可探究新劑型、新工藝的使用, 以增加何氏養(yǎng)腎方的生物利用度。