O-GlcNAc糖基化修飾誘導(dǎo)髓核細(xì)胞自噬作用機(jī)制的體外實(shí)驗(yàn)*

孫鵬霄， 胡洪波， 李 政， 李玉民

(渭南市中心醫(yī)院 骨外科， 陜西 渭南 714000)

椎間盤退化性病變(intervertebral disc degeneration，IVD)是造成下腰痛的主要原因，其病理機(jī)制是衰老的髓核(nucleus pulpous，NP)細(xì)胞凋亡促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的分泌、細(xì)胞內(nèi)免疫細(xì)胞的聚集以及細(xì)胞外基質(zhì)的數(shù)量減少，同時(shí)增加的降解酶會(huì)進(jìn)一步消化細(xì)胞外基質(zhì)組織、合成不足的細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化容易導(dǎo)致椎間盤的異常負(fù)荷，從而進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)分解，最終導(dǎo)致椎間盤結(jié)構(gòu)破壞。研究表明，衰老組織中調(diào)節(jié)OGA糖基化的酶表達(dá)增加，細(xì)胞在受到誘導(dǎo)凋亡時(shí)，Bcl-2和Bax基因在細(xì)胞存活或者死亡中發(fā)揮重要作用[1]；此外，Caspase-3在細(xì)胞凋亡的終末途徑中也有重要作用，降低Caspase-3的活性，具有抗凋亡的作用[2-4]。若抑制促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表達(dá)，增強(qiáng)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，則可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞促凋亡和抗凋亡信號(hào)通路平衡，保護(hù)細(xì)胞。細(xì)胞受到損害時(shí)，自噬(autophagy)途徑會(huì)被激活，自噬信號(hào)通路的激活可以起到細(xì)胞保護(hù)作用[5-7]。若上調(diào)自噬蛋白Beclin-1和Lc3B/Lc3A的比值，則可保護(hù)細(xì)胞，即可通過自噬的自我修復(fù)程序降低細(xì)胞損傷。而Bax是與Bcl-2同源的水溶性相關(guān)蛋白，是BCL-2基因家族中細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因，Bax的過度表達(dá)可拮抗Bcl-2的保護(hù)效應(yīng)而使細(xì)胞趨于死亡。關(guān)于能否通過調(diào)節(jié)NP細(xì)胞的OGA來增加NP細(xì)胞的保護(hù)性自噬，防治衰老誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和椎間盤退行性變的研究尚未見報(bào)道。本研究擬通過調(diào)節(jié)NP細(xì)胞O-GlcNAc糖基化修飾、觀察其對自噬作用調(diào)節(jié)，以期為椎間盤退行性變的治療指明新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)選用健康、清潔級(jí)成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，符合國家二級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2主要試劑 DMEM液體培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司，胎牛血清購自美國GIBCO公司，Ⅱ型膠原酶及胰蛋白酶C購自美國Sigma公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國HyClone公司，單丹磺酰戊二胺(MDC)購自美國Sigma公司，自噬抑制劑購自美國3-MA

1.2 方法

1.2.1大鼠NP細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 選取12周齡、健康雄性SD大鼠，腹腔注射5%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉，肌注阿托品0.04 mg，待大鼠翻正反射及角膜反射消失，將其俯臥位固定、無菌條件下截取SD大鼠胸腰段脊柱組織，在無菌超凈臺(tái)提取大鼠椎間盤髓核組織。將髓核組織用組織剪剪碎后加入0.25% Ⅱ型膠原酶消化5 min，采用200目過濾網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞過濾液進(jìn)行離心(1 000 g，5 min)，使用含有15%胎牛血清的DMEM-F 12細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮NP細(xì)胞，存放于濃度為5%的CO2、95% O2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每2 d更換培養(yǎng)液1次，倒置顯微鏡觀察NP細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，取第二代SD大鼠NP細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2分組 第二代SD大鼠胸腰段椎間盤NP細(xì)胞分為對照組和實(shí)驗(yàn)組,對照組為經(jīng)過壓力培養(yǎng)的第二代SD大鼠NP細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過壓力培養(yǎng)的NP細(xì)胞分別選用氧聯(lián)乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶(O-GlcNAc transferase,OGT)和氧聯(lián)乙酰葡萄糖胺水解酶(O-GlcNAcase,OGA)進(jìn)行干預(yù)，再分為OGT組和OGA組。

1.2.3步驟 將生長狀況優(yōu)良的第二代SD大鼠胸腰段椎間盤NP細(xì)胞分別接種至24孔板，加0.5 mL培養(yǎng)基，細(xì)胞接種密度為1.5×106/cm2，存放于濃度為5%的CO2、95% O2的培養(yǎng)箱中，在37 ℃條件下培養(yǎng)過夜，NP細(xì)胞完全貼壁后將NP細(xì)胞培養(yǎng)板置入壓力培養(yǎng)裝置中，設(shè)為對照組；實(shí)驗(yàn)組中OGT組為在壓力條件下NP細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)加入O-GlcNAc 促進(jìn)劑OGT，OGA組加入O-GlcNAc 抑制劑OGA。各組大鼠NP細(xì)胞壓力條件下培養(yǎng)時(shí)間分別為0 h、12 h、 24 h、36 h及48 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處取出24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，吸出培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，用溫PBS洗滌2次，將濃度0.06 mmol/L MDC 100微升加入24孔板，避光37 ℃條件下孵育20 min，然后用溫PBS洗滌3次。采用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)一步定量分析NP細(xì)胞出現(xiàn)自噬空泡細(xì)胞的比率及陽性細(xì)胞的比例以及NP細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例，并分析在OGT/OGA作用下細(xì)胞存活比例。在0 h、12 h、 24 h、36 h及48 h各時(shí)間點(diǎn)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)對NP細(xì)胞自噬和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測。通過提取各組NP細(xì)胞mRNA分別檢測自噬相關(guān)基因LC3B、Beclin-1的表達(dá)情況和凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Bcl-2及Bax的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 陽性細(xì)胞比例

在1 MPa壓力條件培養(yǎng)下于各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察，可見第二代SD大鼠胸腰段NP細(xì)胞內(nèi)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)，大鼠NP細(xì)胞中自噬空泡數(shù)量逐漸增加。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，對照組和OGA組SD大鼠NP細(xì)胞內(nèi)陽性細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間延續(xù)，自噬空泡陽性細(xì)胞數(shù)目逐漸增加，至36 h時(shí)達(dá)到峰值、48 h后有所減少；與對照組比較，OGA組24 h、36 h及48 h時(shí)的陽性細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)。見圖1。

(1)與Control組同時(shí)點(diǎn)比較，P<0.05圖1 OGA組和對照組第二代SD大鼠胸腰段椎間盤NP細(xì)胞自噬空泡細(xì)胞比例 Fig.1 The effect of OGA on the percentage of autophagic vacuolar positive cells

2.2 凋亡細(xì)胞比例

在1 MPa壓力條件培養(yǎng)下于各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察，可見第二代SD大鼠NP細(xì)胞內(nèi)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)，大鼠NP細(xì)胞中凋亡細(xì)胞所占比例逐漸增加。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，對照組和OGA組SD大鼠NP細(xì)胞內(nèi)凋亡細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間延續(xù)數(shù)目逐漸增加，至48 h時(shí)達(dá)到峰值。與對照組比較，OGA組24 h、36 h及48 h時(shí)的凋亡細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 在1 MPa壓力培養(yǎng)條件下SD大鼠胸腰段椎間盤NP細(xì)胞凋亡情況Tab.1 Quantitative analysis of of NP cellular apoptosis under pressure culture

2.3 SD大鼠存活的NP細(xì)胞

在1 MPa壓力條件培養(yǎng)下于各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察，可見第二代SD大鼠胸腰段椎間盤NP細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)， NP細(xì)胞存活比例逐漸下降；流式細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，對照組和OGA組NP細(xì)胞存活細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，OGA組24 h、36 h及48 h時(shí)的存活的NP細(xì)胞比例顯著高于對照組(P<0.05)。

2.4 NP細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Caspas-3、LC3B 及Beclin-1 mRNA表達(dá)

在1MPa壓力條件培養(yǎng)下于各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定OGA組與對照組NP細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)情況，可見第二代SD大鼠NP細(xì)胞內(nèi)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)，大鼠NP細(xì)胞中Bcl-2基因的表達(dá)逐漸減少，Caspase-3及BaxmRNA的表達(dá)逐漸增多；OGA組與對照組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較細(xì)胞凋亡相關(guān)Bcl-2 mRNA的表達(dá)減少幅度顯著，Caspase-3及BaxmRNA的表達(dá)增加的幅度顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。在1 MPa壓力條件培養(yǎng)下于各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定OGT組與對照組NP細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)情況，可見第二代SD大鼠NP細(xì)胞內(nèi)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)，大鼠NP細(xì)胞中LC3B與Beclin-1 mRNA的表達(dá)逐漸增加(P<0.05)，至36 h時(shí)達(dá)至峰值，48 h時(shí)降低，在12 h及之后各時(shí)間點(diǎn)OGT組表達(dá)情況均顯著高于對照組(P<0.05)，見表3。

表2 在1 MPa壓力培養(yǎng)條件下SD大鼠胸腰段椎間盤NP細(xì)胞存活比例Tab.2 The survival rates of NP cells under pressure culture

表3 大鼠NP細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Caspas-3、LC3B 及Beclin-1基因表達(dá)Tab.3 The mRNA levels of Bcl-2, Bax, Caspas-3, LC3B and Beclin-1

3 討論

IVD是發(fā)生在脊柱的肌肉骨骼疾病，會(huì)造成腰背部疼痛和身體殘疾，導(dǎo)致個(gè)人生活困難和經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)調(diào)查，椎間盤退變好發(fā)于18～64歲，亦是此類人群去醫(yī)院就診的最常見的原因。在歐美國家，與IVD相關(guān)的社會(huì)經(jīng)濟(jì)損失估計(jì)每年在美國達(dá)850億美元，在英國更達(dá)到120億英鎊[8-9]。椎間盤位于相鄰的兩片軟骨終板之間, 以中央的NP細(xì)胞及周圍的纖維環(huán)(annulus fibrosus，AF)為主要構(gòu)造。NP細(xì)胞為凝膠狀,具有類似減震器的功能，可以將壓力自內(nèi)向外往周圍的纖維環(huán)和相鄰椎體間釋放分?jǐn)?shù)。NP主要是由Ⅱ型膠原蛋白和彈性蛋白纖維結(jié)構(gòu)而成的一個(gè)不規(guī)則的網(wǎng)絡(luò), 這網(wǎng)絡(luò)可以將蛋白多糖基質(zhì)和水分子攏聚在一起。NP內(nèi)的主要蛋白多糖成分是蛋白聚糖聚合物，這種分子中含有大量的陰離子糖胺聚糖的側(cè)鏈，這使得NP得以吸收大量水份從而抵消壓縮載荷。而纖維環(huán)AF由約20個(gè)同心環(huán)(片)的高度組織化I型膠原纖維組成，這使其具有最大的拉伸強(qiáng)度。椎間盤也包含其他膠原、蛋白多糖及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，其可給位于NP和AF的細(xì)胞提供各種物理和生化信號(hào)[10-11]。 NP的細(xì)胞外基質(zhì)成分包括彈性蛋白(elastin)、小分子蛋白多糖及III、VI、IX型膠原和層粘連蛋白[12]，其中某些分子(如VI型膠原蛋白和n-鈣黏著蛋白)可通過NP細(xì)胞表面受體與NP細(xì)胞相互作用。另外，這些細(xì)胞外基質(zhì)成分還能通過調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸、水化和膨脹壓力等方式以機(jī)械性方式作用于NP細(xì)胞。這些作用被認(rèn)為對椎間盤的發(fā)展、功能維持、自我修復(fù)等過程相當(dāng)重要，然而，研究人員對這些詳細(xì)機(jī)制仍知之甚少。研究者普遍認(rèn)為椎間盤退化性病變是ECM過度代謝的后果。細(xì)胞外基質(zhì)中大分子的降解會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和成分發(fā)生變化。在椎間盤退化性病變的過程中，NP和AF區(qū)域的細(xì)胞密度和細(xì)胞集群數(shù)量會(huì)急劇減少[13]。隨著細(xì)胞密度的減小，NP區(qū)域的巨大空泡狀胞漿細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)橐蝗后w積小﹑數(shù)目少且獨(dú)立分布的軟骨樣細(xì)胞[14]。同時(shí)，ECM中蛋白多糖基質(zhì)丟失還能引起ECM結(jié)構(gòu)的變化，從而降低固定負(fù)電荷密度和水分含量，導(dǎo)致膨脹壓力的喪失[15]。 NP區(qū)域發(fā)生的這些變化將導(dǎo)致AF承受異常負(fù)荷，因而導(dǎo)致ECM發(fā)生進(jìn)一步分解，最終導(dǎo)致椎間盤結(jié)構(gòu)破壞。NP細(xì)胞是軟骨細(xì)胞特異性細(xì)胞外基質(zhì)的重要來源。研究表明椎間盤退化性病變起始于NP區(qū)域, NP細(xì)胞的過度凋亡是椎間盤退化性病變過程中最重要的結(jié)構(gòu)和生化變化[16-17]。過度凋亡可造成NP細(xì)胞數(shù)量減少，并導(dǎo)致ECM的合成減少。 ECM分泌不足最終引發(fā)椎間盤退化性病變。因此，預(yù)防NP細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是減少ECM降解﹑延緩椎間盤退化性病變的最新研究焦點(diǎn)，亦是治療的潛力新途徑。

自噬是一種降解過程, 過程中部分細(xì)胞胞漿與溶酶體雙膜囊泡融合形成自噬性溶酶體。這是一種細(xì)胞自我保護(hù)過程:細(xì)胞質(zhì)通過胞質(zhì)大分子降解提供富含能量的化合物來進(jìn)行自我更新，以在外部或內(nèi)部資源日益減少時(shí)滿足細(xì)胞的能量需求。這一過程同時(shí)也可幫助清除老舊蛋白或受損的蛋白和胞器，即通過回收胞質(zhì)成分來保持蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的質(zhì)量。因此，自噬在細(xì)胞的生長、存活、分化和代謝中起著重要的作用，是細(xì)胞一種主要的自我保護(hù)作用而不是自我毀滅的過程[18-19]。細(xì)胞凋亡和自噬在人體的發(fā)育、生理以及疾病的發(fā)生發(fā)展中都很重要。最近的研究表明，盡管凋亡和自噬間有顯著差異，但它們的調(diào)節(jié)卻是密切相關(guān)的，而且共享相同的調(diào)控機(jī)制，因此凋亡和自噬可以互相調(diào)節(jié)。例如，細(xì)胞自噬伴隨著Bcl-2從Beclin1的釋放，以及FLIP從Atg3的釋放，而自由態(tài)的Bcl-2和FLIP可阻止細(xì)胞凋亡[20-21]。從生理的角度來看，自噬對決定細(xì)胞死亡是相當(dāng)重要的，可以通過防止不必要的細(xì)胞凋亡來保護(hù)細(xì)胞[22]。

本研究結(jié)果顯示，OGA作為O-GlcNAc 抑制劑能夠通過抑制O-GlcNAc 糖基化修飾過程來促進(jìn)NP細(xì)胞自噬過程的發(fā)生，進(jìn)而對NP細(xì)胞凋亡過程發(fā)揮抑制作用。GA作為O-GlcNAc 抑制劑能夠通過抑制O-GlcNAc 糖基化修飾過程來促進(jìn)NP細(xì)胞自噬過程的發(fā)生，進(jìn)而對NP細(xì)胞凋亡過程發(fā)揮抑制作用。OGA作為O-GlcNAc 抑制劑能夠通過抑制O-GlcNAc 糖基化修飾過程來促進(jìn)NP細(xì)胞自噬過程的發(fā)生，進(jìn)而對NP細(xì)胞凋亡過程發(fā)揮抑制作用，增加NP細(xì)胞存活的比例。除了細(xì)胞凋亡的調(diào)控，自噬也參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。據(jù)報(bào)道，自噬反應(yīng)缺陷的Atg16l1基因敲除小鼠對LPS刺激的炎癥反應(yīng)顯著高于正常對照, 包括caspase1的過度激活和IL-1β的大幅增加[23]。在衰老的過程中，自噬相關(guān)基因包括LC3、Beclin1和ULK1在不同的組織中均下調(diào)，提示這些組織中自噬作用的減少[24-25]。同時(shí)，椎間盤退化性病變過程中自發(fā)產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子增加，這將進(jìn)一步導(dǎo)致更多的炎性介質(zhì)釋放并促進(jìn)椎間盤退化性病變發(fā)展[26]。理論上若提高自噬水平應(yīng)可阻止細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的發(fā)生。最近，O-GlcNAc糖基化做為蛋白質(zhì)糖基化修飾的一種形式，也被證明可以調(diào)節(jié)自噬。O-GlcNAc糖基化是將單糖分子N-乙酰葡糖胺通過β-糖苷鍵添加到細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)多肽上的絲氨酸或蘇氨酸殘基的一種糖基化過程。 O-GlcNAc的添加是由N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶催化；而移除則是由 N-乙?；咸烟擒彰复呋コ?。由于O-GlcNAc糖基化的絲氨酸/蘇氨酸殘基往往與蛋白激酶磷酸化修飾位點(diǎn)是重復(fù)或接近的，所以O(shè)-GlcNAc糖基化往往可以通過與蛋白激酶相互作用參與多種細(xì)胞途徑和功能調(diào)節(jié)[27]。如同磷酸化過程一樣，借著OGA/OGT的調(diào)控，O-GlcNAc糖基化與蛋白質(zhì)磷酸化修飾相互作用，參與許多細(xì)胞調(diào)控過程。本研究還表明，O-GlcNAc糖基化參與調(diào)節(jié)自噬反應(yīng)。因此，通過調(diào)控O-GlcNAc糖基化來調(diào)節(jié)NP細(xì)胞自噬以影響椎間盤退化性病變成為一個(gè)相當(dāng)有潛力的研究焦點(diǎn)。