丹防膠囊對(duì)免疫性肝纖維化大鼠肝組織IL-33和ST2表達(dá)的影響*

李 璨， 陸 爽*， 吳 君， 程明亮

(貴州醫(yī)科大學(xué) 感染病學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550004)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是由于某些因素?fù)p傷肝細(xì)胞后發(fā)生慢性炎癥、壞死，導(dǎo)致大量的膠原纖維沉積于匯管區(qū)和肝小葉內(nèi)的一種病理性改變，其發(fā)生的中心環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)活化致使細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)的合成和降解失衡[1]。在HF時(shí)，活化的HSC可分泌白介素33(interleukin-33，IL-33)，并能在HSC細(xì)胞膜上觀察到腫瘤發(fā)生抑制蛋白2 (suppression of tumorigenicity 2，ST2)[2]。有研究表明，當(dāng)發(fā)生急性或大規(guī)模肝損傷時(shí)，IL-33的釋放可能作為組織保護(hù)機(jī)制的激活物；而在慢性損傷中，IL-33則具有促纖維化的作用[3]。丹防膠囊是一種復(fù)方制劑，前期研究發(fā)現(xiàn)其在豬血清誘導(dǎo)的大鼠免疫性HF模型中具有抗HF作用[4]。復(fù)方鱉甲軟肝片則是目前臨床上常用、療效頗佳的抗HF藥物。因此，本研究對(duì)免疫性HF模型大鼠給與丹防膠囊干預(yù)治療，觀察大鼠肝組織IL-33、ST2的表達(dá)，探討丹防膠囊對(duì)大鼠免疫性HF干預(yù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥物 40只清潔級(jí)雄性SD大鼠(180±20)g由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(SYXK黔2015-0001)，丹防膠囊(貴陽天陽公司，自制復(fù)方制劑，尚未進(jìn)行新藥申報(bào))，復(fù)方鱉甲軟肝片購于內(nèi)蒙古中蒙藥科技公司(20150123)。本研究獲得貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(1402050)。

1.1.2主要試劑 IL-33抗體(Abcam ab207737)、ST2抗體(武漢三鷹11920-1-AP)、GAPDH抗體(Cell Signaling 14C10)、山羊抗兔二抗(中杉金橋 ZB-2301)、引物(上海生工)、TB Green premix Ex TaqII(Tli RNaseH plus)、TAKARA BIO INC RR820A、總RNA提取試劑盒(TianGen Dp 419)、primeScrip t RT reagent kit with gDNA Eraser(TAKARA BIO INC RR047A)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組及處理 40只清潔級(jí)雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字法平均分為模型組、陰性對(duì)照組、丹防組及陽性對(duì)照組，每組10只。模型組、丹防組、陽性對(duì)照組腹腔注射0.5 mL/只[4]豬血清構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，陰性對(duì)照組腹腔注射生理鹽水0.5 mL/只，2次/周，共12周。造模同時(shí)，丹防組每天予4.32 g/kg[4]丹防膠囊灌胃，陽性對(duì)照組予0.54 g/kg[4]復(fù)方鱉甲軟肝片灌胃，模型組和陰性對(duì)照組予等量生理鹽水灌胃，1次/d，共12周[4]。12周末麻醉處死大鼠，取各組大鼠肝右葉相同部位肝組織經(jīng)甲醛固定后石蠟包埋，行蘇木素—伊紅(HE)染色觀察大鼠肝組織病理學(xué)改變，參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行纖維化分期；剩余新鮮肝組織存于-80 ℃冰箱，用免疫組化、Western Blot及Q-PCR檢測(cè)大鼠肝組織中IL-33、ST2蛋白及IL-33 mRNA的表達(dá)。

1.2.2免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝組織切片IL-33、ST2表達(dá) 各組石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、不同濃度酒精水化及枸櫞酸鈉液抗原修復(fù)，一抗IL-33(1∶1 000)、ST2(1∶300)4 ℃孵育過夜，二抗常溫孵育30 min。DAB試劑染色3～5 min、復(fù)染1～3 min、返藍(lán)1 min、中性樹膠封片，顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取4個(gè)高倍鏡觀察定位，利用Image J計(jì)算平均光密度值。

1.2.3Western Blot檢測(cè)肝組織勻漿IL-33、ST2蛋白表達(dá) 利用超聲震碎提取肝組織蛋白，分別配制8%和12% SDS-PAGE凝膠后電泳及轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，一抗IL-33(1∶1 000)、ST2(1∶2 000)、GAPDH(1∶6 000)4 ℃孵育過夜，二抗(1∶5 000)常溫孵育50 min后ELC曝光，GAPDH作為內(nèi)參，Image J對(duì)各組蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.2.4Q-PCR檢測(cè)肝組織IL-33 mRNA表達(dá) 按照試劑盒說明書提取肝組織總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄后加入引物、模板與熒光染料，制備10 μL體系樣品進(jìn)行熒光定量實(shí)時(shí)檢測(cè)。以GAPDH為內(nèi)參照，每組樣本在相同條件(預(yù)變性95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 60 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán))下重復(fù)3次，采用2-ΔΔCT值計(jì)算各組大鼠IL-33 mRNA相對(duì)表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 Q-PCR引物序列及序列片段Tab.1 Q-PCR primer sequence and sequence fragment

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

實(shí)驗(yàn)過程中，各組大鼠一般狀態(tài)良好，正常飲食。實(shí)驗(yàn)第4周，模型組1只大鼠因肺部有出血灶死亡，其余各組大鼠未出現(xiàn)死亡情況。

2.2 肝組織切片病理學(xué)改變

陰性對(duì)照組肝組織結(jié)構(gòu)完整清晰，以中央靜脈為中心，肝細(xì)胞呈放射狀排列，在匯管區(qū)及肝組織中未見膠原纖維增生。模型組大部分肝實(shí)質(zhì)被破壞，肝細(xì)胞不規(guī)則排列，匯管區(qū)可觀察到膠原纖維增生呈條索狀延伸至肝實(shí)質(zhì)內(nèi)形成纖維間隔，分割并破壞肝小葉，部分區(qū)域甚至形成假小葉結(jié)構(gòu)。丹防組和陽性對(duì)照組的HF程度較模型組明顯減輕，大部分正常肝小葉結(jié)構(gòu)保留，纖維間隔變細(xì)，無假小葉結(jié)構(gòu)形成。丹防組與陽性對(duì)照組的HF程度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

注：A為模型組，B為陰性對(duì)照組，C為丹防組，D為陽性對(duì)照組圖1 各組大鼠肝組織切片病理學(xué)改變(HE，×40)Fig.1 HE staining of liver tissue of rats in each group

2.3 肝組織IL-33、ST2蛋白表達(dá)

IL-33定位于細(xì)胞核，ST2定位于細(xì)胞質(zhì)。與陰性對(duì)照組比較，模型組和丹防組的IL-33、ST2表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，丹防組和陽性對(duì)照組的IL-33、ST2表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與陽性對(duì)照組比較，丹防組的IL-33、ST2表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2和圖2。

2.4 肝組織勻漿IL-33、ST2蛋白表達(dá)

與陰性對(duì)照組比較，模型組及丹防組的IL-33、ST2表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，丹防組與陽性對(duì)照組的IL-33、ST2表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；與陽性對(duì)照組比較，丹防組的IL-33、ST2表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

表2 各組大鼠肝組織ST2及IL-33蛋白表達(dá)Tab.2 Expression of ST2 and IL-33 in liver tissue of rats in each group

(1)與模型組比較，P<0.05；(2)與陰性對(duì)照組比較，P<0.05；(3)與陽性對(duì)照組比較，P<0.05

注：A為模型組，B為陰性對(duì)照組，C為丹防組，D為陽性對(duì)照組圖2 各組大鼠肝組織ST2及IL-33蛋白表達(dá)(HE，×400)Fig.2 Expression of ST2 and IL-33 in liver tissue of rats in each group

注：A為模型組，B為陰性對(duì)照組，C為丹防組，D為陽性對(duì)照組；(1)與模型組比較，P<0.05；(2)與陰性對(duì)照組比較，P<0.05；(3)與陽性對(duì)照組比較，P<0.05圖3 各組大鼠肝組織IL-33及ST2蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of IL-33 and ST2 protein in liver tissue of rats in each group

2.5 肝組織IL-33 mRNA的表達(dá)

與陰性對(duì)照組比較，模型組與丹防組的IL-33 mRNA表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，丹防組與陽性對(duì)照組的IL-33 mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與陽性對(duì)照組比較，丹防組的IL-33 mRNA表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

注：A為模型組，B為陰性對(duì)照組，C為丹防組，D為陽性對(duì)照組；(1)與模型組比較,P<0.05；(2)與陰性對(duì)照組比較,P<0.05；(3)與陽性對(duì)照組比較，P<0.05圖4 各組大鼠肝組織中IL-33 mRNA表達(dá)Fig.4 Expression levels of IL-33 mRNA in liver tissue of rats in each group

3 討論

IL-33最初是在蛛網(wǎng)膜下腔出血后犬腦血管痙攣的研究中發(fā)現(xiàn)的，因其高表達(dá)而受到關(guān)注[3]，廣泛表達(dá)于固有免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，具有細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子雙重功能[5-7]。當(dāng)發(fā)生急性或大面積肝細(xì)胞損傷時(shí)，IL-33的釋放作為組織保護(hù)機(jī)制的因子，可減輕肝細(xì)胞的受損程度；然而，在慢性肝組織損傷中，IL-33則可作為一種肝細(xì)胞受損的“預(yù)警”因子，表現(xiàn)出促HF的作用[3]。ST2作為IL-33的受體，在未發(fā)現(xiàn)其配體IL-33前，一直被認(rèn)為是孤立受體[5]。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠和人的ST2廣泛在心肝脾腎肺腦等多種器官中表達(dá)[8]，也在如CD4+、CD8+T細(xì)胞、T調(diào)節(jié)細(xì)胞(Tregs)等適應(yīng)性免疫的細(xì)胞中表達(dá)[9]。越來越多的研究表明，IL-33/ST2通路可參與HF的發(fā)生及發(fā)展[7,10,11]。Sun Z等[2,12]發(fā)現(xiàn)小鼠和人纖維化肝臟中IL-33水平以及IL-33、ST2 mRNA表達(dá)均高于正常肝臟組織，其表達(dá)水平的高低與纖維化的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。ST2在HF的發(fā)生發(fā)展中也具有重要作用。已有研究證明，在沒有跨膜型ST2L的情況下，肝臟損傷、炎性細(xì)胞浸潤和纖維化程度降低；此外，ST2L缺陷小鼠在四氯化碳的作用下，并未觀察到膠原蛋白的增加[2]。研究還發(fā)現(xiàn)，在ST2缺乏的HF小鼠中，HSC的活化降低[11]。

目前，中藥制劑抗HF的研究已獲得較多驗(yàn)證，且具有多靶點(diǎn)、副作用相對(duì)較小的優(yōu)點(diǎn)[13-15]。丹防膠囊是由土鱉、鱉甲、漢防己、丹參、銀杏葉、黃芪、三七、龜板及熟大黃9種已被證實(shí)有較好抗纖維化效果的單方組成的復(fù)方制劑[16-23]，本實(shí)驗(yàn)前期的研究發(fā)現(xiàn)丹防膠囊對(duì)免疫性大鼠HF有一定干預(yù)作用，其中以高劑量組效果最顯著[4]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)丹防膠囊可抑制大鼠肝星狀細(xì)胞的增殖[24]。本研究在上述研究基礎(chǔ)上，結(jié)合其他學(xué)者關(guān)于IL-33/ST2與HF關(guān)系的研究結(jié)論，選擇了高劑量丹防膠囊對(duì)豬血清誘導(dǎo)的大鼠HF進(jìn)行干預(yù)，同時(shí)檢測(cè)各組大鼠肝組織IL-33及ST2的表達(dá)，進(jìn)一步探討丹防膠囊對(duì)大鼠免疫性HF的干預(yù)作用是否與IL-33、ST2的表達(dá)相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，HF組大鼠肝組織實(shí)質(zhì)被廣泛破壞，匯管區(qū)可觀察到大量膠原纖維增生，有纖維間隔形成，部分區(qū)域可見典型假小葉形成，提示已成功復(fù)制豬血清誘導(dǎo)的免疫性大鼠HF模型。與HF組相比，丹防膠囊組、復(fù)方鱉甲軟肝片組HF程度明顯減輕，僅少部分匯管區(qū)可觀察到膠原纖維增生，纖維間隔變細(xì)，未見明顯假小葉形成。綜上提示丹防膠囊對(duì)免疫性大鼠HF有一定的干預(yù)作用。與正常肝組織比較，IL-33基因及蛋白、ST2蛋白在HF組織中表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，本研究結(jié)果與Sun Z等人[2]的結(jié)果一致，提示IL-33/ST2參與了HF的形成。但經(jīng)丹防膠囊干預(yù)后，IL-33基因及蛋白、ST2蛋白的表達(dá)較HF組明顯下降(P<0.05)，與Sun Z[2]發(fā)現(xiàn)的在ST2缺乏的HF小鼠中HSC的活化降低及趙雪珂發(fā)現(xiàn)的丹防膠囊可抑制大鼠肝星狀細(xì)胞的增殖的研究結(jié)果相結(jié)合，提示了丹防膠囊可能通過降低IL-33、ST2的表達(dá)進(jìn)而抑制HSC的增殖、活化，從而發(fā)揮其對(duì)HF的干預(yù)作用。然而，比較丹防組與陽性對(duì)照組發(fā)現(xiàn)，兩組大鼠肝組織病理學(xué)改變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但丹防組IL-33基因及蛋白、ST2蛋白表達(dá)高于陽性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示丹防膠囊除了可以通過影響IL-33、ST2的表達(dá)進(jìn)行抗HF外，可能還能通過其他信號(hào)通路發(fā)揮干預(yù)作用，需進(jìn)一步探究丹防膠囊對(duì)大鼠免疫性HF干預(yù)的作用機(jī)制。

綜上，探究丹防膠囊對(duì)HF的干預(yù)機(jī)制可進(jìn)一步驗(yàn)證中藥有效成分抗HF在分子水平的作用機(jī)制，為今后中藥抗HF提供有效的理論依據(jù)。