含氟或氯取代的馬蹄金素衍生物的合成及其抗乙肝病毒活性研究*

況安香， 曾曉萍， 曹 盼1,， 梁光義***， 徐必學(xué)***

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng) 550025; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550014; 3.貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550014)

乙型肝炎(乙肝)是由乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)感染引起的、嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一[1]，目前治療乙肝的藥物主要有以α-干擾素為代表的生物類免疫調(diào)節(jié)劑和恩替卡韋等為代表的核苷(酸)類藥物[2-3]，但這些藥物均不能完全治愈乙肝[4-5]，因此，研究開發(fā)具有新化學(xué)結(jié)構(gòu)類型的乙肝治療藥物具有重要意義。馬蹄金素[N-(N-苯甲酰基-L-苯丙氨?；?-O-乙酰基-L-苯丙氨醇，MTS，圖1]是本課題組從苗藥馬蹄金中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)具有抗乙肝病毒活性的先導(dǎo)化合物[6-8]，其衍生物Y101已經(jīng)獲得臨床批件并完成了一期臨床試驗(yàn)[9-11]。鑒于MTS為二肽基本母核，與現(xiàn)在臨床上的核苷類抗乙肝藥物的基本骨架完全不同，值得廣泛深入探討MTS基本母核上不同取代基對(duì)其抗乙肝病毒的影響。對(duì)生物分子用鹵素(Cl、Br、I和F)修飾是藥物化學(xué)研究的熱點(diǎn)，約40%的鹵化藥物進(jìn)入市場(chǎng)或臨床前試驗(yàn)階段，約25%的有機(jī)鹵化藥物進(jìn)入市場(chǎng)，而34%的鹵化藥物仍處于研發(fā)階段[12- 13]，這表明鹵素在藥物研發(fā)中起著重要的作用，其中又以含氟或氯取代的應(yīng)用更為廣泛[14]。為探討含氟或氯取代對(duì)MTS衍生物在抗HBV活性方面的影響，本研究設(shè)計(jì)合成了一系列含氟或氯取代的MTS衍生物，并對(duì)其進(jìn)行了抗HBV的評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑

儀器有XT-4型熔點(diǎn)儀(溫度未校正)、德國(guó)布魯克公司AVANCE NEO-600 MHz型超導(dǎo)核磁共振儀、美國(guó)Varian公司Inova-400 MHz型超導(dǎo)核磁共振儀(以TMS為內(nèi)標(biāo))、美國(guó)Hewlett-Packard公司HP-5793質(zhì)譜儀、青島海洋化工廠生產(chǎn)的柱色譜硅膠(300～400目)及高效薄層板。試劑均為市售分析純或化學(xué)純產(chǎn)品，除特別說(shuō)明外，未經(jīng)處理直接使用。2.2.15細(xì)胞為 HBV DNA克隆轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1目標(biāo)化合物3a、3b和4a～4c合成 參照文獻(xiàn)[8]的方法，取L-酪氨酸甲酯鹽酸鹽1.1 mmol與 2-氯苯甲酸(4-氟苯甲酸或4-氯苯甲酸)1.0 mmol于反應(yīng)瓶中，加入無(wú)水二氯甲烷(DCM)50 mL和N-甲基嗎啉(NMM)2.3 mmol攪拌溶解完全，于0 ℃氬氣保護(hù)下滴加含氯甲酸異丁酯(IBCF) 126 μL(1.0 mmol)和DCM 2 mL的混合溶液，0 ℃繼續(xù)攪拌5 h。減壓回收DCM，殘留物用乙酸乙酯和水分散，萃取；所得有機(jī)層依次以蒸餾水、稀鹽酸、飽和碳酸氫鈉、飽和氯化鈉洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸干；將所得固體物溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)2 mL中，加入1.0 moL/L氫氧化鈉溶液3 mL，室溫?cái)嚢? h，反應(yīng)液以濃鹽酸調(diào)至pH 2～3，加入乙酸乙酯和水，萃?。凰糜袡C(jī)層依次以蒸餾水、飽和氯化鈉洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮至干即得中間體N-(2-氯-苯甲?；?-L-酪氨酸(2a)、N-(4-氟-苯甲酰基)-L-酪氨酸(2b)、N-(4-氯-苯甲酰基)-L-酪氨酸(2c)；將前一步合成的中間體2a1.0 mmol與L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽1.1 mmol于反應(yīng)瓶?jī)?nèi)，加入無(wú)水DCM 50 mL和NMM 2.3 mmol攪拌溶解完全，于0 ℃氬氣保護(hù)下滴加含IBCF 126 μL(1.0 mmol)和DCM 2 mL的混合溶液，后0 ℃繼續(xù)攪拌5 h，反應(yīng)液減壓回收DCM，剩余物以乙酸乙酯和水分散，萃取，所得有機(jī)層依次用蒸餾水、稀鹽酸、飽和碳酸氫鈉以及飽和氯化鈉洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸干，所得固體經(jīng)硅膠柱層析純化得狀目標(biāo)化合物3a。參照合成3a的方法可制備得3b和4a～4c。合成路線見圖2。

1.2.1.1N-[N-(2-氯苯甲?；?-L-酪氨?；鵠-L-苯丙氨酸甲酯(3a) 白色粉末，收率74.5%。EI-MSm/z: 480 (M+),325,274,180,163,139 (100),120,107,91,77;1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:9.20 (s,1H),8.52 (d,J=8.8 Hz,1H),8.43 (d,J=8.0 Hz,1H),7.46～7.16 (m,9H),7.07 (d,J=8.4 Hz,2H),6.66 (d,J=8.4 Hz,2H),4.64 (m,1H),4.53 (m,1H),3.59 (s,3H),3.07-2.67 (m,4H);13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 171.8,171.2,165.9,155.8,137.0,136.4,130.8,130.2,130.0,129.6,129.2,128.9,128.3,127.8,126.9,126.6,114.8,54.4,53.8,51.9,36.7,36.5。

1.2.1.2N-[N-(4-氟苯甲?；?-L-酪氨?；鵠-L-苯丙氨酸甲酯(3b) 白色粉末，收率68.4%。EI-MSm/z: 464 (M+),325,258,180,163,147,123 (100),95;1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 9.20 (s,1H),8.55 (m,2H),7.86 (m,2H),7.30～7.13 (m,7H),7.04 (d,J=8.4,2H),7.02 (d,J=8.4,2H),4.64 (m,1H),4.50 (m,1H),3.59 (s,3H),3.09～2.79 (m,4H);13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 171.8,171.8,165.1,162.7,155.7,137.1,130.6,130.5,130.2,130.1,130.0,129.1,128.3,126.6,115.2,115.0,114.8,54.9,53.7,51.9,36.6,36.2。

1.2.1.3N-[N-(2-氯苯甲?；?-L-酪氨酰基]-L-苯丙氨醇(4a) 淡黃色粉末，收率84.9%。EI-MSm/z: 452 (M+),434,297,274,206,139 (100),120,107,91,77;1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 9.19 (s,1H),8.50 (d,J=8.4 Hz,1H),7.78 (d,J=8.8 Hz,1H),7.46～7.16 (m,9H),7.04 (d,J=8.4 Hz,2H),6.65 (d,J=8.4 Hz,2H),4.83 (t,J=5.6 Hz,1H),4.56 (m,1H),3.91 (m,1H),3.34～3.24 (m,2H),2.91～2.85 (m,2H),2.74-2.63 (m,2H);13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 170.5,165.8,155.7,139.0,136.5,130.8,130.2,130.0,129.6,129.2,128.9,128.1,127.9,126.9,125.9,114.5,62.1,54.8,52.3,36.8,36.4。

1.2.1.4N-[N-(4-氟苯甲?；?-L-酪氨?；鵠-L-苯丙氨醇(4b) 白色粉末，收率66.9%。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 9.18 (s,1H),8.51 (d,J=8.4 Hz,1H),7.90～7.87 (m,3H),7.31～7.00 (m,6H),6.63 (d,J=8.4 Hz,2H),4.83 (t,J=5.6 Hz,1H),4.60 (m,1H),3.90 (m,1H),3.38～3.23 (m,2H),2.95～2.56 (m,4H);13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 171.3,171.1,165.0,162.7,155.7,139.1,130.1,130.0,129.2,128.4,128.1,125.9,115.2,115.0,114.8,69.8,55.2,52.5,36.5,36.4。

1.2.1.5N-[N-(4-氯苯甲酰基)-L-酪氨?；鵠-L-苯丙氨醇(4c) 白色粉末，收率55.3%。EI-MSm/z: 452 (M+),434,297,274,206,139 (100),120,107,91,77;1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 9.15 (s,1H),8.54 (d,J=8.4 Hz,1H),7.87 (d,J=8.4 Hz,1H),7.81 (d,J=8.4 Hz,2H),7.53 (d,J=8.4 Hz,2H),7.25～7.12 (m,5H),7.07 (d,J=8.0 Hz,2H),6.60 (d,J=8.0 Hz,2H),4.80 (t,J=5.2 Hz,1H),4.57 (m,1H),3.88 (m,1H),3.35～3.24 (m,2H),2.95～2.60 (m,4H);13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 170.9,164.9,155.7,139.0,136.1,132.9,130.1,129.4,129.2,128.33,128.28,128.1,125.9,114.8,62.2,55.2,52.5,36.5,36.4。

1.2.2目標(biāo)化合物5a～5e的合成通法 取化合物4c1.0 mmol與碳酸鉀3.0 mmol于反應(yīng)瓶?jī)?nèi)，加入DMF 10 mL，攪拌下加入碘甲烷1.1 mmol，室溫?cái)嚢柚练磻?yīng)完全，將反應(yīng)液分散于乙酸乙酯和水中，萃取，所得有機(jī)層依次以水、飽和氯化鈉洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸干，所得固體經(jīng)硅膠柱層析純化即得5a。同法，以碘代乙烷、碘代丙烷、碘代異丙烷或二甲氨基氯乙烷鹽酸鹽替換碘甲烷，可分別制得5b～5e。合成路線見圖2。

1.2.2.1N-[N-(4-氯苯甲?；?-O-甲基-L-酪氨酰基]-L-苯丙氨醇(5a) 白色粉末，收率76.5%。ESI-MSm/z: 955.5 [2M+Na]+;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 8.57 (d,J=8.5 Hz,1H),7.90 (d,J=8.4 Hz,1H),7.84～7.78 (m,2H),7.55～7.50 (m,2H),7.25～7.15 (m,6H),7.16～7.09 (m,1H),6.82～6.76 (m,2H),4.83 (t,J=5.4 Hz,1H),4.64～4.57 (m,1H),3.92～3.84 (m,1H),3.67 (s,3H),3.33 (dd,J=10.6,5.1 Hz,1H),3.27 (dd,J=10.8,5.7 Hz,1H),2.95 (dd,J=13.8,4.5 Hz,1H),2.89～2.83 (m,2H),2.66 (dd,J=13.7,8.0 Hz,1H);13C-NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ: 171.01,165.11,157.78,139.06,136.18,132.87,130.23,129.44,129.27,128.37,128.14,125.99,113.51,62.28,55.22,54.95,52.54,36.47。

1.2.2.2N-[N-(4-氯苯甲?；?-O-乙基-L-酪氨?；鵠-L-苯丙氨醇(5b) 參考5a合成方法，以碘乙烷替換碘甲烷合成目標(biāo)化合物5b，白色粉末，收率60.6%。ESI-MSm/z: 503.2 [M+Na]+;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 8.56 (d,J=8.5 Hz,1H),7.88 (d,J=8.4 Hz,1H),7.85～7.79 (m,2H),7.57～7.50 (m,2H),7.25～7.16 (m,6H),7.16～7.09 (m,1H),6.81～6.75 (m,2H),4.79 (t,J=5.5 Hz,1H),4.66～4.59 (m,1H),3.96～3.87 (m,3H),3.38～3.31 (m,1H),3.31～3.26 (m,1H),2.96 (dd,J=13.8,4.6 Hz,1H),2.88 (dd,J=8.0,2.4 Hz,1H),2.86 (dd,J=7.9,2.1 Hz,2H),2.67 (dd,J=13.6,8.0 Hz,1H),1.28 (t,J=6.9 Hz,3H);13C-NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ: 171.38,165.48,157.46,139.48,136.55,133.32,130.62,130.51,129.84,129.66,128.75,128.53,126.36,114.38,63.24,62.68,55.60,52.94,36.88,15.15。

1.2.2.3N-[N-(4-氯苯甲?；?-O-丙基-L-酪氨?；鵠-L-苯丙氨醇(5c)制備 參考5a合成方法，以碘丙烷替換碘甲烷合成目標(biāo)化合物5c，白色粉末，收率71.1%。ESI-MSm/z: 517.2 [M+Na]+;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 8.56 (d,J=8.5 Hz,1H),7.89 (d,J=8.3 Hz,1H),7.83 (d,J=8.2 Hz,2H),7.53 (d,J=8.2 Hz,2H),7.26～7.16 (m,6H),7.13 (t,J=7.6 Hz,1H),6.79 (d,J=8.2 Hz,2H),4.79 (t,J=5.5 Hz,1H),4.62 (td,J=9.4,4.4 Hz,1H),3.91～3.86 (m,1H),3.84 (t,J=6.6 Hz,2H),3.37～3.32 (m,1H),3.31～3.26 (m,1H),2.96 (dd,J=13.9,4.5 Hz,1H),2.87 (dd,J=14.0,8.0 Hz,2H),2.67 (dd,J=13.8,8.0 Hz,1H),1.71～1.64 (m,2H),0.94 (t,J=7.4 Hz,3H);13C-NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ: 171.38,165.50,156.35,139.48,136.55,133.33,130.66,130.40,129.84,129.66,128.74,128.52,126.36,115.62,69.36,62.68,55.60,52.95,36.91,36.88,22.31。

1.2.2.4N-[N-(4-氯苯甲酰基)-O-異丙基-L-酪氨?；鵠-L-苯丙氨醇(5d)的制備 參考5a合成方法，以碘代異丙烷替換碘甲烷合成目標(biāo)化合物5d，白色粉末，收率60.9%。ESI-MSm/z: 517.2 [M+Na]+;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 8.57 (d,J=8.5 Hz,1H),7.88 (d,J=8.4 Hz,1H),7.85～7.81 (m,2H),7.56～7.50 (m,2H),7.25～7.17 (m,6H),7.16～7.10 (m,1H),6.80～6.74 (m,2H),4.79 (t,J=5.5 Hz,1H),4.66～4.59 (m,1H),4.56～4.48 (m,1H),3.96～3.86 (m,1H),3.38～3.32 (m,1H),3.31～3.26 (m,1H),2.96 (dd,J=13.9,4.7 Hz,1H),2.92～2.83 (m,2H),2.67 (dd,J=13.7,8.0 Hz,1H),1.21 (d,J=1.6 Hz,3H),1.20 (d,J=1.5 Hz,3H);13C-NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ: 171.38,165.50,156.35,139.48,136.55,133.33,130.66,130.40,129.84,129.66,128.74,128.52,126.36,115.62,69.36,62.68,55.60,52.95,36.91,36.88,22.31。

1.2.2.5N-[N-(4-氯苯甲?；?-O-二甲氨基乙基-L-酪氨酰基]-L-苯丙氨醇(5e) 白色結(jié)晶，收率46.6%。ESI-MSm/z: 525.2 [M+H]+;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 8.57 (d,J=8.5 Hz,1H),7.89 (d,J=8.3 Hz,1H),7.85～7.80 (m,2H),7.57～7.51 (m,2H),7.26～7.16 (m,6H),7.16～7.11 (m,1H),6.84～6.77 (m,2H),4.80 (t,J=5.5 Hz,1H),4.66～4.59 (m,1H),3.96 (t,J=5.9 Hz,2H),3.94～3.87 (m,1H),3.38～3.31 (m,1H),3.31～3.27 (m,1H),2.97 (dd,J=13.8,4.5 Hz,1H),2.91～2.84 (m,2H),2.67 (dd,J=13.7,8.0 Hz,1H),2.56 (d,J=11.8 Hz,2H),2.18 (s,6H);13C-NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ: 171.38,165.49,157.44,139.47,136.56,133.31,130.63,129.84,129.66,128.75,128.53,126.36,114.47,66.09,62.68,58.21,55.60,52.95,46.02,36.89。

圖2 目標(biāo)化合物的合成路線圖Fig.2 Synthetic route for target compounds

1.3 馬蹄金素衍生物體外抗HBV活性研究

取2.2.15細(xì)胞接種96孔培養(yǎng)板，24 h后加入不同濃度的樣品液(3a、3b、4a、4b、4c、5a、5b、5c、5d、5e、MTS)、空白對(duì)照液或拉米夫定(lamivudine)陽(yáng)性對(duì)照液。培養(yǎng)3 d后，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，1 000 r/min離心10 min，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 200 μL，振蕩10 min，形成的結(jié)晶充分溶解后、用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定其吸光度值(OD值)，采用改良寇氏法計(jì)算藥物的半數(shù)有毒濃度。另取2.2.15細(xì)胞接種96孔培養(yǎng)板，24 h后分別加入不同濃度的樣品(3a、3b、4a、4b、4c、5a、5b、5c、5d、5e、MTS)及陽(yáng)性對(duì)照藥拉米夫定，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照孔，加藥后每72 h分別更換含不同稀釋濃度樣品的培養(yǎng)液，于加藥后第8日分別收集2.2.15細(xì)胞，采用斑點(diǎn)雜交的方法檢測(cè)細(xì)胞中HBV DNA的復(fù)制程度，分別計(jì)算IC50及藥物選擇性指數(shù)(SI)[15]。

2 結(jié)果

通過(guò)化學(xué)方法合成了10個(gè)含氟或氯取代的MTS衍生物，并對(duì)所合成的目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行體外抗HBV 活性測(cè)試，結(jié)果顯示其中有8個(gè)目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)HBV DNA的復(fù)制有不同程度的抑制活性?；衔?a、5c、5d表現(xiàn)出良好的抗HBV活性，其IC50為12.61、10.53、6.46 μmol/L。見表1。

表1 目標(biāo)化合物對(duì)2.2.15細(xì)胞DNA復(fù)制的抑制活性Tab.1 Inhibitory effect of the target compounds on HBV DNA in 2.2.15 cell

注：“-”表示樣品在測(cè)試濃度范圍內(nèi)無(wú)活性

3 討論

本文以具有抗HBV活性的MTS為先導(dǎo)化合物，通過(guò)在其B環(huán)引入氟或氯取代，設(shè)計(jì)合成了10個(gè)衍生物，由表1中目標(biāo)化合物的抗HBV活性測(cè)試結(jié)果可以看出，A環(huán)為4-羥基取代的化合物活性相對(duì)較低；對(duì)化合物4c中A環(huán)4-位酚羥基進(jìn)行甲基化、丙基化或異丙基化取代后所得化合物5a、5c、5d的抗HBV活性顯著提高，特別是其中甲基化取代的化合物5a，其細(xì)胞毒性還略有降低，SI達(dá)到53.0，說(shuō)明含氟或氯原子取代的MTS衍生物具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。