Toll樣受體4在膿毒癥并發(fā)急性肺損傷中的作用*

陳歐， 湯展宏， 胡軍濤

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 (廣西南寧 530021)

膿毒癥是一種由感染引起的生理、病理和生化異常綜合征，可導(dǎo)致器官損害并危及生命，最常見的病原菌是革蘭陰性細(xì)菌，細(xì)菌表面的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)結(jié)構(gòu)是誘導(dǎo)膿毒癥產(chǎn)生的關(guān)鍵成分[1]。目前膿毒癥的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，雖然真正的發(fā)病率尚不清楚，但保守估計(jì)表明，膿毒癥已經(jīng)是全世界范圍內(nèi)造成死亡和危重病的主要原因[2-3]。其高昂的治療費(fèi)用以及對(duì)醫(yī)療資源的巨大消耗，嚴(yán)重影響了人類的生活健康、生存質(zhì)量，對(duì)人類的生活造成了巨大的威脅。膿毒癥炎癥反應(yīng)中因促炎因子和抗炎因子的調(diào)控、釋放失衡，過(guò)度釋放的炎癥因子可以造成內(nèi)皮細(xì)胞的損害和血管通透性的增加，從而導(dǎo)致血容量的喪失以及組織細(xì)胞水腫，從而引起包括肺組織在內(nèi)的全身靶器官的損害，造成全身性炎癥反應(yīng)。其中急性肺損傷是膿毒癥患者最常見的并發(fā)癥及主要的死亡原因[4]。Toll樣受體是哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的第一類模式識(shí)別受體，是先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)之間的重要紐帶[5-6]。LPS作為革蘭陰性菌表面的抗原物質(zhì)，與Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)結(jié)合時(shí)可激活其下游信號(hào)傳導(dǎo)通路，引起炎癥介質(zhì)的釋放從而導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)[7-8]。2018年3—9月，本實(shí)驗(yàn)旨在研究TLR4在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥肺損傷中的作用及相關(guān)機(jī)制，以期為臨床治療提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 LPS(美國(guó)Sigma公司)，戊巴比妥鈉(上海西塘生物科技有限公司)，小鼠腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)ELISA試劑盒(艾美捷科技有限公司)，蛋白提取試劑盒(北京Solarbio公司)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京Solarbio公司)核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)，β-actin多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)，山羊抗兔二抗(美國(guó)Abcam公司)

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 雄性普通小鼠(C57BL/10J)和TLR4 基因敲除小鼠(C57BL/10ScNJNJU)各16只，8周齡，體重 22～24 g，均購(gòu)自南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(蘇)2015-0001。在恒溫恒濕，相同條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲水，進(jìn)食普通飼料，人工照明12 h/d。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)要求進(jìn)行。

按隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠均分為普通小鼠對(duì)照組(wild-type，WT組)、普通小鼠模型組(WT+LPS組)、TLR4基因敲除小鼠對(duì)照組(TLR4 knockout，TLR4-ko組)、TLR4基因敲除小鼠模型組(TLR4-ko+LPS組)，每組8只。模型組腹腔內(nèi)注射20 mg/kg LPS[9]，對(duì)照組小鼠腹腔內(nèi)注射等體積的生理鹽水，24 h后在戊巴比妥鈉麻醉下經(jīng)內(nèi)眥靜脈采血后，用眼科剪剪開小鼠胸腔，將肺組織分離取出，放置于盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中，洗凈肺表面附著的血液，剪下小鼠右肺，浸泡在多聚甲醛中進(jìn)行固定，留待后續(xù)做病理切片，余肺置于-80℃冰箱，留待檢測(cè)肺組織中NF-κB蛋白含量。

1.3 方法

1.3.1 ELISA法檢測(cè)小鼠血清中TNF-α含量變化 小鼠血液標(biāo)本在4℃冰箱靜置12 h，然后離心取上清液，置于-20℃冰箱保存，具體操作步驟參照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，最后采用雙波長(zhǎng)讀數(shù)，用酶標(biāo)儀在450 nm和530 nm波長(zhǎng)下分別測(cè)量各孔的吸光度值，以兩者的差值作為最終的OD值。

1.3.2 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察及肺損傷評(píng)分 肺組織在多聚甲醛中固定24 h后，依常規(guī)進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟處理后以HE染色，在光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化，并對(duì)肺損傷嚴(yán)重程度進(jìn)行半定量評(píng)分：評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)按照Smith評(píng)分體系[10-11]，依據(jù)肺水腫、肺泡及間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡及間質(zhì)出血、肺不張和透明膜的形成等5項(xiàng)指標(biāo)分別進(jìn)行肺損傷嚴(yán)重程度評(píng)分(0分為氣管、肺泡及間質(zhì)均正常；1分為損傷病變范圍小于視野的25%；2分為損傷病變范圍在25%～50%之間；3分為損傷病變范圍在50%～75%之間；4分為損傷病變范圍大于視野的75%)，總分16分，上述各項(xiàng)指標(biāo)分?jǐn)?shù)的總和即為肺損傷的總評(píng)分。

1.3.3 Western blot檢測(cè)肺組織中NF-κB蛋白表達(dá) 從-80℃冰箱中取出凍存肺組織，用眼科剪盡量剪碎后放入裂解液，勻漿后收集上清液，用BCA法進(jìn)行蛋白含量的檢測(cè)。將樣品稀釋到合適濃度后進(jìn)行PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上封閉60 min，加入一抗NF-κB抗體，將膜在4℃下孵育過(guò)夜，然后與二抗孵育1 h。通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法觀察條帶，并在成像儀器中進(jìn)行定量。其中β-actin作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 小鼠取材前一般狀態(tài) WT+LPS組小鼠出現(xiàn)活動(dòng)度下降，倦怠少食，伴明顯氣促，眼鼻偶見膿白色分泌物等現(xiàn)象，有20%病死率；TLR4-ko+LPS組小鼠癥狀明顯較輕；WT組及TLR4-ko組小鼠精神、進(jìn)食、活動(dòng)狀況均未見明顯異常。

2.2 各組小鼠肺組織病理學(xué)改變及肺損傷評(píng)分 (1)各組小鼠肺組織HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察：WT+LPS組鏡下肺泡腔內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血明顯，且伴有肺泡擴(kuò)張不均勻，部分肺泡萎陷、破裂、融合，肺泡壁增厚、肺泡間隔的增寬，局灶性肺出血，偶可見透明膜形成；TLR4-ko+LPS組也可見輕度肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張、出血，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁增厚的表現(xiàn)，但未見明顯肺泡塌陷、破壞。WT組及TLR4-ko組肺泡形態(tài)大小正常，肺泡壁清晰可見，無(wú)肺泡紊亂和肺泡塌陷，肺間質(zhì)中未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1。肺損傷評(píng)分：與WT組相比，WT+LPS組小鼠肺組織損傷評(píng)分顯著增高(P<0.01)，TLR4-ko+LPS組與WT+LPS組相比肺損傷程度明顯減輕(P<0.01)，WT組及TLR4-ko組肺損傷評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

A：TLR4-ko組；B：WT組；C：TLR4-ko+LPS組；D：WT+LPS組

2.3 血清TNF-α的表達(dá)水平 ELISA結(jié)果顯示：與WT組比較，WT+LPS組小鼠TNF-α表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；TLR4-ko組炎癥介質(zhì)表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) 。TLR4-ko+LPS組炎癥介質(zhì)表達(dá)較WT+LPS 組明顯下降(P<0.01)。見表1。

項(xiàng)目n肺損傷評(píng)分(分)TNF-α(ng/L)WT組80.88±0.3513.57±1.51TLR4-ko組80.75±0.4614.12±1.31WT+LPS組86.12±0.99?△80.68±19.05?△TLR4-ko+LPS組82.62±0.91▲33.08±4.74▲F值92.92881.704P值0.0000.000

*與WT組比較P<0.01；△與TLR4-ko+LPS組比較P<0.01；▲與TLR4-ko組比較P<0.01

2.4 肺組織NF-κB蛋白的表達(dá) 蛋白條帶可見，WT組小鼠肺組織僅有少量NF-κB蛋白表達(dá)，與WT組相比，WT+LPS組NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(0.33±0.02vs. 0.66±0.01,P=0.000)。TLR4-ko組和TLR4-ko+LPS組中NF-κB蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.50±0.06vs. 0.52±0.04,P=0.597)。此外，WT+LPS組蛋白表達(dá)水平高于TLR4-ko+LPS組(0.66±0.01vs. 0.52±0.04,P=0.005)。β-actin為內(nèi)參。見圖2。

3 討論

膿毒癥是由于感染引起的全身性炎癥反應(yīng)，因宿主對(duì)感染微生物的復(fù)雜免疫、炎癥反應(yīng)，膿毒癥常導(dǎo)致致命性休克、凝血障礙和多器官功能衰竭甚至死亡，臨床上約半數(shù)的膿毒癥患者常會(huì)并發(fā)肺損傷。 近年來(lái)盡管隨著醫(yī)療水平的提高，專業(yè)重癥監(jiān)護(hù)和肺保護(hù)性機(jī)械通氣策略的出現(xiàn)，在抗感染和支持性治療方面取得了重大進(jìn)展，但是很少有治療方法在膿毒癥肺損傷的管理中被證明是有效的，其仍然是重癥監(jiān)護(hù)病房住院和死亡的主要原因[12-13]。因此尋找有效的治療策略去克服這一難題是具有重要臨床意義的。

1：WT 組；2：WT+LPS 組；3：TLR4-ko 組；4：TLR4-ko+LPS 組

膿毒癥并發(fā)肺損傷過(guò)程中涉及多種途徑和機(jī)制，盡管國(guó)內(nèi)外對(duì)其機(jī)制探討進(jìn)行了很多新的研究，如膿毒癥時(shí)IQ模序的三磷酸鳥苷酶活化蛋白1(IQGAP1)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所引起的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變[14]，膿毒癥介導(dǎo)交感神經(jīng)興奮毒性引起肺損傷炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展[15]，但就目前研究而言，其免疫抑制機(jī)制尚未完全清楚。研究表明膿毒癥并發(fā)肺損傷時(shí)中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)聚集活化，釋放大量的炎癥介質(zhì)，并協(xié)同蛋白酶和活性氧對(duì)肺泡上皮細(xì)胞與肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷，使肺泡毛細(xì)血管屏障受損，同時(shí)上皮損傷不僅有助于水腫液的積聚和促炎介質(zhì)的產(chǎn)生，還會(huì)導(dǎo)致表面活性物質(zhì)的產(chǎn)生和功能受損以及異常的液體轉(zhuǎn)運(yùn)，從而導(dǎo)致水腫液的清除受損，影響肺通氣和換氣功能，進(jìn)一步加重肺損傷程度[16-18]。因此膿毒癥肺損傷的發(fā)生發(fā)展主要是與促炎細(xì)胞因子的過(guò)度釋放有關(guān)，治療的關(guān)鍵就在于阻斷炎癥因子的大量釋放。

研究表明，肺損傷發(fā)病的起始環(huán)節(jié)、炎癥因子的大量釋放與TLR4的表達(dá)、激活有著密切的關(guān)系[19-20]。并且TLR4/NF-κB信號(hào)通路是急性肺損傷發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的一個(gè)重要的信號(hào)通路。當(dāng)LPS與免疫細(xì)胞表面的TLR4、CD14、MD-2組成的復(fù)合物結(jié)合后，可啟動(dòng)激活免疫細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[21-22]。免疫細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等的激活，通過(guò)TLR4胞內(nèi)鏈接蛋白如髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)，激活白細(xì)胞介素-1(IL-1)受體鏈接蛋白激酶(IL-1 receptor associated kinase，IRAK)和信號(hào)分子腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor-associated factor 6, TRAF6)，啟動(dòng)炎癥細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活多種酶和轉(zhuǎn)錄因子，使下游NF-κB抑制性蛋白IκB磷酸化激活，NF-κB得以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，有研究表明NF-κB的活化與急性肺損傷的發(fā)生密切相關(guān)[23]。通過(guò)這一系列的級(jí)聯(lián)信號(hào)傳遞，導(dǎo)致單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生釋放大量TNF-α、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)等炎癥介質(zhì)并促進(jìn)各種黏附分子的表達(dá)[24-25]，當(dāng)大量炎癥因子經(jīng)血液循環(huán)流至肺部時(shí)，TNF-α等前炎癥因子通過(guò)上調(diào)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中E-選擇素 、黏附分子等的表達(dá)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞的聚集，激活并釋放大量的溶酶體酶、氧自由基等對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞造成直接的損傷，此外還可正反饋激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路，引起炎癥因子的爆發(fā)性合成釋放。

在本實(shí)驗(yàn)中我們通過(guò)采取小鼠腹腔注射LPS的方法來(lái)復(fù)制膿毒癥肺損傷模型。與WT組和TLR4-ko組小鼠相比，WT+LPS組小鼠肺組織病理改變明顯，可觀察到肺泡腔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、充血明顯，伴肺泡壁明顯增厚，肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞、出血及透明膜形成；TLR4-ko+LPS組小鼠在光鏡下觀察可見輕微炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、出血、肺泡間隔增厚，說(shuō)明模型建造成功。且WT+LPS組與TLR4-ko+LPS組相比其肺組織損傷程度、肺組織NF-κB蛋白含量以及TNF-α表達(dá)水平明顯增加，以上結(jié)果說(shuō)明TLR4在內(nèi)毒素所致的膿毒癥肺損傷的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有著重要作用，且TLR4基因缺陷后可以抑制的膿毒癥炎癥因子的大量釋放，并且對(duì)其并發(fā)的急性肺損傷有一定保護(hù)作用。

綜上所述，內(nèi)毒素感染引起的膿毒癥可以并發(fā)急性肺損傷，這可能與細(xì)菌內(nèi)毒素和免疫細(xì)胞結(jié)合后通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路，引起炎癥因子大量釋放，并誘導(dǎo)激活肺泡巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在肺內(nèi)聚集，造成組織損傷有關(guān)。敲除TLR4基因后，可以抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路，下調(diào)TNF-α的水平，從而減輕膿毒癥的炎癥反應(yīng)，并可改善肺組織損傷情況。本研究通過(guò)TLR4基因敲除小鼠，明確了TLR4在LPS誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥肺損傷模型的發(fā)展過(guò)程中起重要作用，因此可以通過(guò)阻斷TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)減少炎癥介質(zhì)的釋放，從而為臨床上膿毒癥肺損傷的患者提供新的治療靶點(diǎn)。