利用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵乳桿菌AR497電轉(zhuǎn)化條件

韋云瑩，趙燕，莊金偉，李江，帕米拉·乃則木丁，陸祎晟，艾連中，熊智強(qiáng)

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海食品微生物工程研究中心，上海，200093)

發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)是一種異型發(fā)酵乳酸菌，在發(fā)酵食品的制作和功效方面具有特殊作用，還具有眾多益生功能[1-3]。目前對(duì)發(fā)酵乳桿菌益生作用研究主要集中在胃腸道的耐受性、抗菌活性、降膽固醇、增強(qiáng)免疫活性[4-5]、抗氧化、緩解肝臟和腸道損傷等方面[6]。這些益生功能與發(fā)酵乳桿菌相關(guān)基因的調(diào)控密不可分，而基因的調(diào)控和功能研究依賴于菌株遺傳操作的建立和發(fā)展。因此，確定最佳電轉(zhuǎn)化條件是建立發(fā)酵乳桿菌遺傳體系的前提。發(fā)酵乳桿菌AR497是本實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的1株能有效改善小鼠腸炎的乳酸菌，為研究其抗炎機(jī)理和解析抗炎相關(guān)基因，建立高效的電轉(zhuǎn)化方法至關(guān)重要。

由于目前報(bào)道的乳酸菌電轉(zhuǎn)化方法不能成功應(yīng)用于AR497中，本研究首先建立了發(fā)酵乳桿菌AR497的電轉(zhuǎn)化方法，采用Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出電轉(zhuǎn)化方法中的關(guān)鍵因素，利用響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)電轉(zhuǎn)化條件。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)所用的菌株與質(zhì)粒如表1所示。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：用于AR497的活化、培養(yǎng)和活菌計(jì)數(shù)。LB培養(yǎng)基：用于E.coli的培養(yǎng)。MRSMC1復(fù)蘇培養(yǎng)基：含有0.8 mol/L山梨醇的MRS培養(yǎng)基。MRSMC2復(fù)蘇培養(yǎng)基：含有0.8 mol/L山梨醇，2 mmol/L CaCl2，20 mmol/L MgCl2的MRS培養(yǎng)基。MRSMC3復(fù)蘇培養(yǎng)基：含有0.8 mol/L蔗糖的MRS培養(yǎng)基。MRSMC4復(fù)蘇培養(yǎng)基：含有0.8 mol/L蔗糖，2 mmol/L CaCl2，20 mmol/L MgCl2的MRS培養(yǎng)基。

1.2 發(fā)酵乳桿菌AR497感受態(tài)制備方法

MRS液體培養(yǎng)過(guò)夜，3%接種量接種至含質(zhì)量濃度20 g/L甘氨酸的MRS液體培養(yǎng)基至OD600為0.3～0.4。 4 ℃，4 000×g離心棄上清，體積分?jǐn)?shù)為10%甘油洗滌2次并重懸分裝[7]。每管分裝100 μL保藏-80 ℃，電轉(zhuǎn)化備用。

1.3 發(fā)酵乳桿菌AR497感受態(tài)效率檢測(cè)及鑒定方法

取一定量質(zhì)粒與100 μL感受態(tài)細(xì)胞混勻，迅速轉(zhuǎn)入預(yù)冷無(wú)菌的電轉(zhuǎn)杯中，設(shè)置好電轉(zhuǎn)參數(shù)后電擊。電擊完畢后，立即加入900 μL液體復(fù)蘇培養(yǎng)基，37 ℃靜置4 h后涂布抗性平板，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h后，觀察并記錄轉(zhuǎn)化子個(gè)數(shù)。挑取上述轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR鑒定，采用引物Cm-F(5’-ggaggcatatcaaatgaactttaataaaattgatttagac-3’)/Cm-R(5’-attatctcatattataaaagccagtcattaggcc-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增氯霉素抗性基因。同時(shí)做陰性對(duì)照(以AR497為模板)和陽(yáng)性對(duì)照(以質(zhì)粒pNZ44為模板)，瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)。根據(jù)加入質(zhì)粒的量，計(jì)算每微克質(zhì)粒所得轉(zhuǎn)化子的數(shù)目，計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.4 單因素試驗(yàn)對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響

其他步驟不變的情況下，選擇不同的洗滌緩沖液來(lái)洗滌感受態(tài)細(xì)胞，比較電轉(zhuǎn)化效率，確定合適的洗滌緩沖液。

在獲得最佳洗滌緩沖液的基礎(chǔ)上制備感受態(tài)，分別將質(zhì)量濃度10、20、40、60、80、100 ng/μL的pNZ44質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到發(fā)酵乳桿菌AR497感受態(tài)中，觀察不同質(zhì)粒濃度對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響，確定最佳質(zhì)粒質(zhì)量濃度。

將制備好的感受態(tài)在相同條件下電擊，選擇不同復(fù)蘇培養(yǎng)基(MRSMC)在相同的時(shí)間里復(fù)蘇細(xì)胞。比較電轉(zhuǎn)化效率，確定合適的復(fù)蘇培養(yǎng)基。

1.5 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇甘氨酸質(zhì)量濃度、OD600、電場(chǎng)強(qiáng)度、復(fù)蘇時(shí)間和山梨醇濃度為考察因素，利用Minitab軟件設(shè)計(jì)15次PB試驗(yàn)，進(jìn)行關(guān)鍵因素篩選。結(jié)合前期試驗(yàn)結(jié)果分別設(shè)每個(gè)因素高低2個(gè)水平。因素水平見(jiàn)表2。

1.6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Plackett-Buman試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)篩選得出的關(guān)鍵因素進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，正效應(yīng)的關(guān)鍵因素其梯度為遞增，負(fù)效應(yīng)的關(guān)鍵因素其梯度為遞減，測(cè)定發(fā)酵乳桿菌AR497的電轉(zhuǎn)化效率，尋找最優(yōu)電轉(zhuǎn)化效率區(qū)域。

1.7 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)發(fā)酵乳桿菌AR497電轉(zhuǎn)化條件的關(guān)鍵因素作進(jìn)一步優(yōu)化，獲得其最佳電轉(zhuǎn)化效率。Box-Behnken設(shè)計(jì)見(jiàn)表3。

表3 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平和編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵乳桿菌AR497電轉(zhuǎn)化方法的篩選

前期利用紙片法對(duì)發(fā)酵乳桿菌AR497進(jìn)行耐藥性評(píng)價(jià)[8]，發(fā)現(xiàn)AR497對(duì)氨芐西林、阿莫西林、米諾環(huán)素、萘啶酸、氯霉素和紅霉素有較高的敏感性。由于乳酸菌基因工程操作中常用的抗生素一般為紅霉素和氯霉素，因此本研究選擇具有紅霉素或氯霉素抗性的5種質(zhì)粒。根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道的乳酸菌電轉(zhuǎn)化方法[9-13]，嘗試將5種質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化至AR497感受態(tài)中，但均未成功?；谕跚苫莸萚7]制備干酪乳桿菌感受態(tài)的方法，本研究改變了接種量、生長(zhǎng)培養(yǎng)基中甘氨酸的質(zhì)量濃度和菌體生長(zhǎng)狀況，使AR497能夠成功吸收外源質(zhì)粒。但僅有質(zhì)粒pNZ44和pMG36e能夠成功轉(zhuǎn)化至AR497中，其他質(zhì)粒未能成功，這可能是由于這些質(zhì)粒的復(fù)制子不能夠在AR497中自主復(fù)制。KIM等[14]研究也表明,菌株之間的特異性和質(zhì)粒的來(lái)源會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。

為驗(yàn)證上述轉(zhuǎn)化后得到的克隆為陽(yáng)性，隨機(jī)挑選9個(gè)含有pNZ44的轉(zhuǎn)化子，選用pNZ44上的氯霉素抗性基因片段引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，電泳圖顯示均有條帶且與目的片段(～700bp)大小一致(圖1)，表明pNZ44質(zhì)粒已轉(zhuǎn)化至發(fā)酵乳桿菌AR497中。由于pNZ44在AR497中的電轉(zhuǎn)化效率最高，后續(xù)試驗(yàn)選擇此質(zhì)粒進(jìn)行電轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化。

M-DL 2000 marker；1-陰性對(duì)照；2-陽(yáng)性對(duì)照；3～11-轉(zhuǎn)化子氯霉素(Cm)抗性基因PCR結(jié)果圖1 轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證

Fig.1 Transformants verified by PCR

2.2 不同洗滌緩沖液對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響

制備感受態(tài)時(shí)，洗滌緩沖液通過(guò)洗滌細(xì)胞使感受態(tài)處于理想的離子環(huán)境濃度[15]。洗滌緩沖液中通常含有滲透保護(hù)劑，用于維持細(xì)胞滲透壓，避免細(xì)胞因電穿孔過(guò)度溶脹而破裂，從而提高細(xì)胞存活率。本研究選擇了4種制備乳酸菌感受態(tài)常用的洗滌緩沖液，考察其對(duì)AR497電轉(zhuǎn)化效率的影響。洗滌緩沖液I的電轉(zhuǎn)化效率遠(yuǎn)低于洗滌緩沖液II和III(圖2)，這說(shuō)明加入滲透保護(hù)劑確實(shí)有利于轉(zhuǎn)化效率的提高。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，利用蔗糖作為保護(hù)劑能獲得更高的轉(zhuǎn)化效率，約為3×104CFU/μg DNA，與曹曉梅等[16]研究結(jié)果一致。

圖2 洗滌緩沖液對(duì)發(fā)酵乳桿菌AR497電轉(zhuǎn)化效率的影響

Fig.2 Effect of washing buffer on the electroporationefficiency of L. fermentum AR497

2.3 不同質(zhì)粒濃度對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響

外源質(zhì)粒濃度會(huì)影響電轉(zhuǎn)化效率，細(xì)胞濃度一定時(shí)，添加不同濃度的外源質(zhì)粒得到的轉(zhuǎn)化子數(shù)目不同。質(zhì)粒濃度過(guò)大時(shí)，電轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的電阻較大，易于擊穿電轉(zhuǎn)杯[17]。本研究選擇添加不同濃度的pNZ44質(zhì)粒進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，考察其對(duì)AR497電轉(zhuǎn)化效率的影響。由圖3可知，加入不同濃度質(zhì)粒對(duì)電轉(zhuǎn)化效率有一定的影響。質(zhì)粒質(zhì)量濃度在20 ng/μL左右時(shí)，電轉(zhuǎn)化效率最高達(dá)3.8×104CFU/μg DNA；質(zhì)粒濃度再升高時(shí)，轉(zhuǎn)化效率反而下降。

圖3 不同質(zhì)粒質(zhì)量濃度對(duì)發(fā)酵乳桿菌AR497電轉(zhuǎn)化效率的影響

Fig.3 Effect of different plasmid content on the electropor-ation efficiency of L. fermentum AR497

2.4 不同復(fù)蘇培養(yǎng)基對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響

細(xì)胞經(jīng)電擊后很容易大量死亡，在高滲環(huán)境中復(fù)蘇能夠明顯提高細(xì)胞的存活率[18]。采用4種高滲培養(yǎng)基來(lái)復(fù)蘇電轉(zhuǎn)化后的AR497細(xì)胞，結(jié)果表明，在MRSMC2的培養(yǎng)基中電轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)5.6×104CFU/μg DNA(圖4)。相同濃度山梨醇的轉(zhuǎn)化效率明顯高于蔗糖，說(shuō)明山梨醇更有利于AR497細(xì)胞膜的恢復(fù)。

圖4 不同復(fù)蘇培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵乳桿菌AR497電轉(zhuǎn)化效率的影響

Fig.4 Effect of different medium component on the electro-poration efficiency of L. fermentum AR497

MRSMC2恢復(fù)培養(yǎng)基比MRSMC1恢復(fù)培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)化效率更高，這可能是CaCl2和MgCl2的存在會(huì)促進(jìn)外源DNA的吸收，獲得更多的轉(zhuǎn)化子。

2.5 Plackett-Burman 試驗(yàn)篩選關(guān)鍵因素

在上述單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，本研究采用5因素3水平的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)電轉(zhuǎn)化方法中甘氨酸質(zhì)量濃度、OD600、電場(chǎng)強(qiáng)度、山梨醇濃度和復(fù)蘇時(shí)間進(jìn)行關(guān)鍵因素篩選。利用Minitab軟件對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果(表4)進(jìn)行擬合和方差分析，擬合方程如下：

Y=25 833+17 433X1-18 792X2+22 792X3+4 225X4-18 817X5

影響電轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素顯著性排序?yàn)椋弘妶?chǎng)強(qiáng)度>山梨醇濃度>OD600>甘氨酸質(zhì)量濃度>復(fù)蘇時(shí)間(表5)。其中電場(chǎng)強(qiáng)度(X3)、山梨醇濃度(X5)、OD600(X2)和甘氨酸濃度(X1)對(duì)電轉(zhuǎn)化效率影響顯著(P<0.05)，基于此結(jié)果進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。

表4 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表5 Plackett-Burman 試驗(yàn)各種因素的影響

2.6 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果與分析

隨著甘氨酸質(zhì)量濃度、OD600、電場(chǎng)強(qiáng)度及山梨醇濃度的變化，電轉(zhuǎn)化效率呈先增大后減小的趨勢(shì)(表6)。當(dāng)甘氨酸質(zhì)量濃度為25 g/L，OD600為0.2，電場(chǎng)強(qiáng)度12.5 kV/cm，山梨醇濃度0.5 mol/L時(shí)，AR497的電轉(zhuǎn)化效率最高，說(shuō)明此時(shí)接近最佳響應(yīng)區(qū)域。因此，Box-Behnken試驗(yàn)將此條件作為中心點(diǎn)，對(duì)電轉(zhuǎn)化條件進(jìn)一步優(yōu)化。

表6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Table 6 Experimental design and results of steepest ascent

編號(hào)甘氨酸濃度/(g·L-1)OD600電場(chǎng)強(qiáng)度/(kV·cm-1)山梨醇濃度/(mol·L-1)電轉(zhuǎn)化效率×10-4/(CFU·μg DNA-1)150.307.50.70.05±0.002150.2510.00.610.25±0.233250.2012.50.522.16±0.284350.1515.00.416.22±0.17

2.7 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

在最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)以上4個(gè)顯著因素進(jìn)行優(yōu)化。利用Design Expert軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果(表7)進(jìn)行方差分析及二次多項(xiàng)回歸擬合(表8)，得到發(fā)酵乳桿菌AR497電轉(zhuǎn)化效率對(duì)電場(chǎng)強(qiáng)度(A)、山梨醇濃度(B)、OD600(C)和甘氨酸質(zhì)量濃度(D)的多元回歸方程為：

Y=227 500.00+58 208.33A+14 479.17B+10 386.25C+12 407.08D-20 943.13A2-31 411.87B2-158 800.00C2-49 020.00D2+26 562.50AB+13 250.00AC+187.50AD+

4 500.00BC-1 375.00BD+5 158.75CD

表7 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表8 回歸方程模型顯著性分析

圖5直觀反映了各因素間交互作用對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響，其中，電場(chǎng)強(qiáng)度(A)和山梨醇濃度(B)交互作用的曲面圖斜度更為陡峭，說(shuō)明其交互作用顯著。而其他交互項(xiàng)之間的曲面圖斜度較為平緩，交互作用不顯著。

圖5 各因素交互作用對(duì)發(fā)酵乳桿菌AR497電轉(zhuǎn)化效率的影響

Fig.5 The effect of the factors on the electroporationefficiency of L. fermentum AR497

運(yùn)用Design Expert軟件分析得到發(fā)酵乳桿菌AR497最優(yōu)電轉(zhuǎn)化條件為：電場(chǎng)強(qiáng)度15 kV/cm，山梨醇濃度0.57 mol/L，OD600為0.2，甘氨酸質(zhì)量濃度26.23 g/L，預(yù)測(cè)在此條件下發(fā)酵乳桿菌AR497的電轉(zhuǎn)化率達(dá)到2.8×105CFU/μg DNA。為了方便操作，將上述預(yù)測(cè)的參數(shù)修改為：電場(chǎng)強(qiáng)度15 kV/cm，山梨醇濃度0.6 mol/L，OD600為0.2，甘氨酸濃度26 g/L。按此電轉(zhuǎn)化條件實(shí)際電轉(zhuǎn)化效率為(2.78±0.25)×105CFU/μg DNA，與理論值非常接近，說(shuō)明條件參數(shù)可靠，能夠較好的預(yù)測(cè)發(fā)酵乳桿菌AR497電轉(zhuǎn)化效率。

3 討論

本研究確立了發(fā)酵乳桿菌AR497的電轉(zhuǎn)化方法，使質(zhì)粒pNZ44和pMG36e可成功轉(zhuǎn)化至AR497中。采用單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)電轉(zhuǎn)化條件進(jìn)一步優(yōu)化，確定了制備發(fā)酵乳桿菌AR497的感受態(tài)方法和最佳電轉(zhuǎn)化條件，即3%接種量接種至含有質(zhì)量濃度26 g/L甘氨酸的MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至OD600約0.2，用體積分?jǐn)?shù)10%甘油和0.5 mol/L蔗糖溶液洗滌重懸細(xì)胞2次，電場(chǎng)強(qiáng)度15 kV/cm，電擊后用0.6 mol/L山梨醇，2 mmol/L CaCl2和20 mmol/L MgCl2的MRS培養(yǎng)基復(fù)蘇，在此條件下發(fā)酵乳桿菌AR497電轉(zhuǎn)化效率高達(dá)2.78×105CFU/μg DNA。

LUCHANSKY等[13]研究表明，使用質(zhì)粒pGK12電轉(zhuǎn)至L.fermentum1750中，轉(zhuǎn)化效率高達(dá)9.7×105CFU/μg DNA，但該電轉(zhuǎn)化方法不適用于發(fā)酵乳桿菌AR497，造成轉(zhuǎn)化能力差異的原因可能是質(zhì)粒pGK12和pNZ44的復(fù)制子不同，復(fù)制方式存在的差異，影響了菌株的轉(zhuǎn)化能力；另一種可能就是宿主菌株存在特異性。SERROR等[19]研究也發(fā)現(xiàn)，電轉(zhuǎn)化效率可能與菌株的特異性有關(guān)，他們嘗試用同一種方法制備不同的德氏乳桿菌感受態(tài)并轉(zhuǎn)化，結(jié)果有些菌株沒(méi)有轉(zhuǎn)化子，但有些菌株的轉(zhuǎn)化效率高達(dá)104CFU/μg DNA。RUSH等[10]研究使用質(zhì)粒pNZ17電轉(zhuǎn)至L.fermentumBR11中，轉(zhuǎn)化效率僅為2.0×103CFU/μg DNA，而WEI等[20]研究通過(guò)改變篩選平板上的抗生素濃度，使L.fermentumBR11電轉(zhuǎn)化效率最高達(dá)4.5×104CFU/μg DNA，說(shuō)明抗生素篩選的濃度也會(huì)對(duì)電轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生影響。除上述因素外，影響電轉(zhuǎn)化效率的因素還包括質(zhì)粒來(lái)源、大小，抗生素種類，載體與內(nèi)源質(zhì)粒的相容性等，后期可針對(duì)這些因素進(jìn)行優(yōu)化，有望進(jìn)一步提高AR497的電轉(zhuǎn)化效率。