響應(yīng)面法提高植物乳酸菌和嗜酸乳桿菌發(fā)酵椰奶的活菌數(shù)

謝雨婷，宋明慧，馬毛毛，陳蘢，楊俊，文學(xué)方,3，曽哲靈,3，余平,3*

1(南昌大學(xué) 食品學(xué)院，江西 南昌，330031) 2(南昌大學(xué) 資源環(huán)境與化工學(xué)院，江西 南昌，330031) 3(食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南昌大學(xué))，江西 南昌，330047)

椰子是熱帶主要果品之一，椰奶中富含中碳鏈甘油三酯[1-3]、低聚糖[4]、植物蛋白[5]、鋅、鈣、鐵等對(duì)人體有益的微量元素[6]和多種必需氨基酸[7]，且不含乳糖,具有快速提供能量，益氣生津，祛暑解渴[8]的功能。目前市場(chǎng)上的椰子飲品主要是椰子原汁飲料和風(fēng)味酸奶，因其特有的濃郁椰香、圓潤(rùn)口感而廣受消費(fèi)者喜愛(ài)，而針對(duì)椰奶的益生菌風(fēng)味飲品的開(kāi)發(fā)研究較少[9-10]。椰汁富含利于乳酸菌生長(zhǎng)的天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可提供優(yōu)良的發(fā)酵環(huán)境[8, 11-13]。植物乳桿菌與嗜酸乳桿菌可共生定殖于人體腸道而改善機(jī)體健康[10-17]。相比較于傳統(tǒng)單一的椰子榨汁飲料及市場(chǎng)上常用的嗜熱鏈球菌與乳酸桿菌的菌種配方，選用嗜酸乳桿菌與植物乳桿菌對(duì)新鮮椰奶進(jìn)行混合發(fā)酵，將產(chǎn)生全新的風(fēng)味[18-19]，酸味口感更強(qiáng)，不僅膽固醇含量更低[20]，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更利于人體吸收[11]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化椰奶發(fā)酵條件，為研制出具高活菌數(shù)的益生菌飲料提供支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

新鮮椰子，購(gòu)于海南文昌；嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)與植物乳桿菌(Lactobacillusplantrum)，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)；葡萄糖和蔗糖(市售，食品級(jí))；乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基與乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

冷凍干燥機(jī)(FD-1)，北京德天佑科技發(fā)展有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器(UZWY-2102C)，上海智城分析儀器制造有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(TU-1950)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電子天平(BSA223S)，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9101-2SA)，上海鴻都電子科技有限公司；低速大容量多管離心機(jī)(LXJ-IIB)，上海安亭科學(xué)儀器廠；電熱恒溫水浴鍋(XMTE-8112)，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；循環(huán)水式多用真空泵(SHB-III)，武漢世紀(jì)超杰實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；九陽(yáng)多功能榨汁機(jī)(JYL-C022E)，九陽(yáng)股份有限公司；膠體磨(CRM-50)，廊坊市成瑞機(jī)械設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱(SKP-02.420)，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 椰子預(yù)處理工藝流程

1.3.2 椰奶制備

取新鮮椰子引流出椰子水，再開(kāi)椰殼取椰肉，以質(zhì)量比1∶3加入蒸餾水榨汁，過(guò)濾后與椰子水混合，經(jīng)均質(zhì)過(guò)濾制得新鮮椰奶，呈均勻乳白色，具濃郁椰香，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱。

1.3.3 前調(diào)配及滅菌

根據(jù)嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌的最優(yōu)碳源[21-23]，選擇蔗糖及葡萄糖為前調(diào)配輔料[24-25]，根據(jù)酸甜口感適量添加。90 ℃，滅菌10 min[8-9]。

1.3.4 菌種活化

商用菌種干粉先用乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基溶解，混勻，在乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，挑取單菌落于乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)培，37 ℃活化12 h，活化2～3次。取一部分活化后菌液與30%甘油等體積混合均勻，分管保存于-20 ℃。

1.3.5 菌粉及菌液制備

取另一部分活化的種子液加入3 L乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)培16 h，隨后將菌液在4 000 r/min離心10 min，棄上清取菌泥，加入保護(hù)劑配方[26]，于-80 ℃預(yù)凍4 h，再真空冷凍干燥48 h。采用平板稀釋涂布法測(cè)定菌粉活菌數(shù)[27]，其中嗜酸乳桿菌菌粉菌含量達(dá)1.8×109CFU/g，植物乳桿菌菌粉菌含量達(dá)2.4×109CFU/g。

以滅菌生理鹽水溶解菌粉，適當(dāng)稀釋后使菌懸液菌體濃度為108CFU/mL，用于椰奶發(fā)酵接種。

1.3.6 單因素實(shí)驗(yàn)

以活菌數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別對(duì)發(fā)酵溫度35、37、39、41、43和45 ℃，發(fā)酵時(shí)間14、16、18、20、22和24 h，接種量1.5%、3%、4.5%、6%、7.5%、9%與植物乳桿菌與嗜酸乳桿菌添加比例(Z/S)為0.5、1、1.5、2、2.5進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，采用平板計(jì)數(shù)法稀釋涂布，在37 ℃下培養(yǎng)48 h，觀察并記錄總菌數(shù)，確定各因素的影響效果與適宜范圍。

1.3.7 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，采用Design expert-8軟件應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，選擇發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵時(shí)間(B)、接種量(C)、菌比例(D)作為響應(yīng)變量，編碼水平為-1、0和1，且以活菌數(shù)(Y)作為響應(yīng)值，對(duì)椰奶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵椰奶的活菌數(shù)的影響

取若干潔凈干燥的50 mL滅菌錐形瓶編號(hào)，分別加入30 mL的滅菌椰奶，適量滅菌糖液，接種等量混合菌液后，分別在35、37、39、41、43、45 ℃下恒溫培養(yǎng)20 h后，采用平板計(jì)數(shù)法稀釋涂布，在37 ℃下培養(yǎng)48 h，觀察并記錄總菌數(shù)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵椰奶活菌數(shù)的影響

Fig.1 Effects of fermentation temperature on viable count of the coconut milk beverage注：不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)，下同。

由圖1可以看出，37～43 ℃是嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌的較適生長(zhǎng)溫度范圍，乳桿菌生長(zhǎng)旺盛；39 ℃時(shí)總活菌數(shù)達(dá)到最高，隨后發(fā)酵溫度繼續(xù)增加，飲料活菌數(shù)下降；45 ℃時(shí)，菌種生長(zhǎng)受明顯抑制?？赡苁怯捎谠谶m當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)溫度升高有利于催化各種酶反應(yīng)[28-29]，提高了乳桿菌增殖速率和發(fā)酵產(chǎn)酸速率[1]。因此，基于能量及活菌數(shù)的優(yōu)化考慮，選用發(fā)酵溫度為39 ℃為椰奶益生菌飲料最佳發(fā)酵溫度。

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵椰奶活菌數(shù)的影響

取若干潔凈干燥的50 mL滅菌錐形瓶編號(hào)，分別加入30 mL的滅菌椰奶、適量滅菌糖液，接種等量混合菌液后，在37 ℃下分別恒溫培養(yǎng)14、16、18、20、22和24 h，采用平板計(jì)數(shù)法稀釋涂布，將涂布后的平板在37 ℃下培養(yǎng)48 h，觀察并記錄總菌數(shù)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵椰奶活菌數(shù)的影響

Fig.2 Effects of fermentation time on viable count of the coconut milk beverage

由圖2可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，椰奶中的乳桿菌大量增加，18 h時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最大，隨后趨于平緩，再逐漸下降。這可能是因?yàn)槠鸪蹼S著時(shí)間增加，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足，乳桿菌繁殖加快，菌數(shù)升高；而隨著時(shí)間延長(zhǎng)，飲料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過(guò)多，限制了乳桿菌的生長(zhǎng)，其死亡速率超過(guò)增殖速率，因此菌數(shù)在保持穩(wěn)定后逐漸下降[3, 13,28，30]。綜合考慮，選擇發(fā)酵時(shí)間為18 h。

2.1.3 接種量對(duì)發(fā)酵椰奶的活菌數(shù)的影響

取若干潔凈干燥的50 mL滅菌錐形瓶編號(hào)，分別加入30 mL的滅菌椰奶、適量滅菌糖液，分別接種1.5%、3.0%、4.5%、6%、7.5%、9%的混合菌液，在37 ℃下恒溫培養(yǎng)20 h，采用平板計(jì)數(shù)法稀釋涂布，在37 ℃下培養(yǎng)48 h，觀察并記錄總菌數(shù)，結(jié)果如圖3所示。

圖3 接種量對(duì)發(fā)酵椰奶活菌數(shù)的影響

Fig.3 Effects of f inoculation quantity on viable countof the coconut milk beverage

從圖3可知，隨著接種量的增加，椰奶發(fā)酵飲料活菌數(shù)呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，當(dāng)接種量為7.5%時(shí)，活菌數(shù)達(dá)最大值且隨后趨于平緩。這是由于隨著乳桿菌數(shù)的增加，乳桿菌對(duì)底物利用加快，增殖速率加快；而在有限的發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)環(huán)境內(nèi)，乳桿菌對(duì)底物的利用水平有限，其增殖速率達(dá)到最大值后趨于穩(wěn)定[31]。因此，基于菌成本和活菌數(shù)優(yōu)化的考慮，選擇椰奶發(fā)酵飲料的最佳接種量為7.5%。

2.1.4 菌種添加比例對(duì)發(fā)酵椰奶活菌數(shù)的影響

取若干潔凈干燥的50 mL滅菌錐形瓶編號(hào)，分別加入30 mL的滅菌椰奶、適量滅菌糖液，接種菌比例(Z/S)分別0.5、1.0、1.5、2.0和2.5的等量混合菌液后，在37 ℃下恒溫培養(yǎng)20 h，采用平板計(jì)數(shù)法稀釋涂布，在37 ℃下培養(yǎng)48 h，觀察并記錄總菌數(shù)，結(jié)果如圖4所示。

圖4 菌比例(Z/S)對(duì)發(fā)酵椰奶活菌數(shù)的影響

Fig.4 Effects of f bacteria ratio(Lactobacillus plantarum/Lactobacillus acidophilus)on viable count of the coconut milk beverage

由圖4可知，隨著菌比例(Z/S)的增加，椰奶益生菌飲料活菌含量先增加后減少，當(dāng)菌比例(Z/S)為1～1.75時(shí)，飲料活菌含量保持較高的水平；當(dāng)菌比例(Z/S)為1.5時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最大值，繼續(xù)增加菌比例(Z/S)，活菌含量下降。這可能是因?yàn)楫?dāng)植物乳桿菌與嗜酸乳桿菌的比例接近時(shí)，產(chǎn)生的競(jìng)爭(zhēng)抑制較小，對(duì)營(yíng)養(yǎng)底物的利用實(shí)現(xiàn)較平衡的優(yōu)化，由于嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸及耐酸綜合能力更強(qiáng)[32-33]，因此，選擇菌比例為(Z/S)為1.5。

2.2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素編碼及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

2.2.2 模型建立與顯著性檢驗(yàn)

綜合單因素結(jié)果，選擇發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵時(shí)間(B)、接種量(C)、菌比例(Z/S)(D)4個(gè)因素，通過(guò)4因素3水平的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析方法，確定椰奶發(fā)酵最佳工藝條件，所得實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果

續(xù)表2

實(shí)驗(yàn)號(hào)各因素編碼值A(chǔ)BCD活菌數(shù)×10-8/(CFU·mL-1)1700111.8018-10102.211901011.762001-101.82210-1101.82220-1101.76231-1001.7724-10012.2025-11002.332610011.572700001.852800001.81290-1011.56

以活菌數(shù)(Y)為響應(yīng)值，應(yīng)用Design expert-8軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析，各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響可用如下多元二次回歸方程表示：

Y=1.83-0.17A+0.058B+0.080C-0.029D-0.16AB-0.023AC-0.14AD-0.088BC+0.072AD+5.000E-003CD+0.13A2-0.070B2-0.031C2-0.054D2

(1)

2.2.3 響應(yīng)因素水平的優(yōu)化及模型驗(yàn)證

通過(guò)Design expert-8軟件分析得到椰奶發(fā)酵的最佳條件為：發(fā)酵溫度(A)為41 ℃、發(fā)酵時(shí)間(B)為18 h、接種量(C)為9%、菌比例(Z/S)(D)為1。采用此優(yōu)化條件進(jìn)行發(fā)酵椰奶驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，椰奶飲料活菌數(shù)含量達(dá)2.011×108CFU/mL，與預(yù)測(cè)值相近，重復(fù)性好，表明此模型能較好地優(yōu)化得到椰奶發(fā)酵最佳條件。

表3 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果

續(xù)表3

方差來(lái)源自由度平方和均方F值P值顯著性D210.0190.0197.220.017 7?殘差140.0372.614E-003失擬項(xiàng)100.0343.423E-0035.800.052 5殘差140.0372.61E-03失擬項(xiàng)100.0343.42E-035.80.0525純誤差42.362×10-35.904×10-4總和280.930.064R2=96.08%RMSE=0.051CV=2.81

由表3可知，該模型效應(yīng)極顯著(P<0.01)。該模型的決定系數(shù)為96.08%，修正決定系數(shù)為92.16%；模型的變異系數(shù)CV=2.81，模型變異較??；模型的失擬項(xiàng)差異不顯著，說(shuō)明回歸方程擬合程度高，可用于椰奶發(fā)酵條件的優(yōu)化。該模型的一次項(xiàng)A、C、二次項(xiàng)A2和AB、AD是極顯著項(xiàng)，B、BC、B2和D2是顯著項(xiàng)，其他為非顯著項(xiàng)。因素D的P值為0.069 6>0.05，說(shuō)明菌比例(Z/S)對(duì)活菌數(shù)影響不顯著。影響椰奶發(fā)酵優(yōu)化條件的因素順序?yàn)?發(fā)酵溫度>接種量>發(fā)酵時(shí)間>菌比例(Z/S)。

3 結(jié)論

本文對(duì)發(fā)酵椰奶活菌數(shù)條件進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化。以新鮮椰子為原料，嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌為菌種，優(yōu)化椰奶發(fā)酵飲料活菌數(shù)最佳工藝條件為：發(fā)酵溫度為41 ℃、發(fā)酵時(shí)間為18 h、接種量為9%、菌比例(Z/S)為1，椰奶飲料活菌數(shù)含量達(dá)2.011×108CFU/mL?，F(xiàn)行國(guó)標(biāo)中關(guān)于活性乳酸菌數(shù)值的指標(biāo)要求為出廠時(shí)不小于100萬(wàn)個(gè)/mL，遠(yuǎn)低于1 000萬(wàn)個(gè)/mL的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。該款椰奶飲料活菌數(shù)不僅遠(yuǎn)高于市場(chǎng)標(biāo)準(zhǔn)，也達(dá)到了國(guó)際乳酸菌類飲料活菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。另外，發(fā)酵后的椰奶保留了較純正的椰香，顏色偏乳白色，口感細(xì)膩，質(zhì)地均勻，有利于進(jìn)一步市場(chǎng)利用與開(kāi)發(fā)。

由于本款椰奶發(fā)酵飲料僅添加了蔗糖與葡萄糖做輔料，口味純正較單一，酸味強(qiáng)，發(fā)酵終點(diǎn)pH在3.32～3.49，在實(shí)際生產(chǎn)中，可將在此條件下發(fā)酵的椰奶適當(dāng)稀釋，有利于降低成本，提高經(jīng)濟(jì)效益；另外，可針對(duì)市場(chǎng)需求，添加多種不同輔料以創(chuàng)新更豐富的口感。綜上所述，本文針對(duì)椰奶益生菌飲料生產(chǎn)工藝的活菌數(shù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，對(duì)開(kāi)發(fā)椰奶發(fā)酵產(chǎn)品提供了良好的參考意義及廣闊的市場(chǎng)前景。