細(xì)胞內(nèi)不同形態(tài)Gd基MRI造影劑的T1/T2弛豫性能及造影效果

孫興麗 張艷輝 趙敏敏 譚 波 張海祿 鄧宗武＊,

(1中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)蘇州納米技術(shù)與納米仿生學(xué)院，合肥 230026)

(2中國科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所，蘇州 215123)

0 引 言

磁共振影像(magnetic resonance imaging，MRI)是在均勻磁場中不同生物組織中的水質(zhì)子有序排列形成的磁矩受到特定的微波激發(fā)后，其縱向(T1)弛豫速率和橫向(T2)弛豫速率存在差異，導(dǎo)致回波的信號(hào)強(qiáng)度不同，在影像中形成對(duì)比度差異，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物體的細(xì)胞、組織和器官的結(jié)構(gòu)和功能成像[1]。當(dāng)不同組織的影像對(duì)比度接近時(shí)，通過引入造影劑來改變特定組織中水質(zhì)子的弛豫速率，增強(qiáng)特定組織的對(duì)比度，可實(shí)現(xiàn)對(duì)該特定組織的成像[2-5]。

MRI信號(hào)強(qiáng)度由水質(zhì)子的T1和T2弛豫速率共同決定，造影劑通過改變水質(zhì)子的弛豫速率T1和T2來獲得造影的效果。任何造影劑的引入既加速水質(zhì)子的T1弛豫速率，也加速其T2弛豫速率，但是加速T1弛豫速率導(dǎo)致MR信號(hào)增強(qiáng)，而加速T2弛豫速率會(huì)導(dǎo)致MR信號(hào)減弱，最終的信號(hào)強(qiáng)度或造影效果取決于2個(gè)弛豫速率的變化對(duì)MRI信號(hào)強(qiáng)度影響的相對(duì)幅度[1,6]。目前，Gd基配合物由于T1加速效應(yīng)顯著，是臨床上使用最廣泛的T1型造影劑[2-3,7-8];超順磁氧化鐵納米粒子由于T2加速效應(yīng)顯著，作為T2型造影劑得到廣泛的研究，并且有過有限的臨床應(yīng)用[4-5]。

MRI造影的物理機(jī)制賦予了其高度復(fù)雜性且難以預(yù)測的特點(diǎn)。造影劑對(duì)T1和T2弛豫速率的加速效應(yīng)的相對(duì)強(qiáng)度一方面與造影劑的結(jié)構(gòu)相關(guān)，如超小氧化鐵納米粒子可以呈現(xiàn)顯著的T1增強(qiáng)效應(yīng)[9-10]，而Gd基配合物納米粒子也可以呈現(xiàn)顯著的T2增強(qiáng)效應(yīng)[11-12]。另一方面，造影劑進(jìn)入細(xì)胞或組織中，還與其在細(xì)胞中的聚集和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)高度相關(guān)，更增加了其復(fù)雜程度。近年來，雖然有些這方面的研究報(bào)道[13-16]，但對(duì)其認(rèn)識(shí)還有待進(jìn)一步深入。臨床上，MRI造影一方面主要應(yīng)用于內(nèi)源性的病變組織的診斷，另一方面在外源性移植細(xì)胞的示蹤中也具有很大的應(yīng)用前景。這些不同領(lǐng)域的應(yīng)用要求進(jìn)一步深入了解造影劑與細(xì)胞及組織的作用機(jī)制，以獲得有價(jià)值的影像信息。

本文作者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，特定結(jié)構(gòu)的Gd基配合物通過脈沖電轉(zhuǎn)染標(biāo)記細(xì)胞，在將游離態(tài)造影劑引入細(xì)胞質(zhì)的同時(shí)，也誘導(dǎo)部分造影劑組裝成納米粒子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，2種不同狀態(tài)的造影劑分子對(duì)細(xì)胞水質(zhì)子的弛豫速率影響機(jī)制存在顯著的不同[17-19]。在此基礎(chǔ)上，我們利用異煙肼(INH)的良好生物膜穿透性[20-21]，將其與Gd-DO3A偶聯(lián)，合成小分子造影劑Gd-DO3A-INH。利用脈沖電轉(zhuǎn)染技術(shù)標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞，有效提高進(jìn)入細(xì)胞的Gd-DO3A-INH濃度，并誘導(dǎo)部分Gd-DO3A-INH在細(xì)胞質(zhì)中自組裝成納米粒子。通過體外MRI清楚揭示2種不同狀態(tài)的Gd-DO3A-INH對(duì)細(xì)胞水質(zhì)子弛豫速率的影響機(jī)制及其胞內(nèi)濃度的漲落對(duì)MRI造影效果的影響機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

11.7 T磁共振微成像系統(tǒng)(Bruker，德國)；脈沖電轉(zhuǎn)儀 (壹達(dá)，中國)；2535/2707高效液相色譜儀(Waters，美國)；X series 2電感耦合等離子體發(fā)射質(zhì)譜儀(ICP-MS)(Thermo，美國)；Forma CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國)。

1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷鹽酸鹽購自安耐吉化學(xué)公司(中國)；細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(MTT)購自 Beyotime。血清、培養(yǎng)基 DMEM/F12、胰蛋白酶、雙抗購自Gibco公司(美國)；異煙肼，對(duì)羥基苯甲醛以及其他化學(xué)品購自國藥化學(xué)試劑公司。

1.2 Gd-DO3A-INH的合成

Gd-DO3A-INH的合成步驟如圖1所示。1，4，7-三(叔丁氧羰甲基)-10-(乙酸)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷[DO3A(OtBu)3]的合成由 1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷鹽酸鹽經(jīng)多步反應(yīng)得到[22-23]。在[DO3A(OtBu)3]上偶聯(lián)對(duì)羥基苯甲醛和異煙肼(INH)后脫去叔丁基的保護(hù)，通過高效液相色譜儀分離得到純度為97%的配體DO3A-INH。DO3A-INH與GdCl3配位，反應(yīng)完成后，利用HPLC分離得到Gd-DO3A-INH，純度為90%。利用核磁共振波譜儀獲得DO3A-INH的氫譜圖(Supporting Information，F(xiàn)ig.S1)；利用飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF-MS)儀獲得 DO3A-INH(Fig.S2)和 Gd-DO3AINH的質(zhì)譜圖(Fig.S3)。

DO3A-INH的結(jié)構(gòu)通過質(zhì)譜和核磁共振氫譜表征。DO3A-INH(C31H43N7O9)的相對(duì)分子量為657.31，質(zhì)譜中質(zhì)荷比(m/z)658.4 為[M+H]+，329.6 為[M+2H]2+，220.1為[M+3H]3+。氫譜中化學(xué)位移6.8和7.7處是苯環(huán)的特征峰，化學(xué)位移8.1和8.7處是異煙肼上吡啶環(huán)的特征峰。Gd-DO3A-INH(Gd(C31H40N7O9))相對(duì)分子量為811.94，質(zhì)譜中質(zhì)荷比811.8為 [M]+，407.1 為[M+2H]2+，271.7 為[M+3H]3+。

1.3 Gd-DO3A-INH水溶液的弛豫率

配置一系列不同濃度(0～2.0 mmol·L-1)的 Gd-DO3A-INH水溶液，將配置好的溶液分別轉(zhuǎn)入到1.1 mm內(nèi)徑的毛細(xì)管中。在11.7 T的NMR譜儀上，測量不同濃度Gd-DO3A-INH水溶液的T1和T2值，并通過電感耦合等離子體發(fā)射質(zhì)譜儀(ICP-MS)測量Gd的濃度。

圖1 Gd-DO3A-INH的合成步驟和Gd-DOTA的結(jié)構(gòu)Fig.1 Synthesis procedure of Gd-DO3A-INH and the structure of Gd-DOTA

1.4 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)培養(yǎng)和脈沖電轉(zhuǎn)染標(biāo)記

將 hMSCs接種在 100 mm×20 mm(每皿約 1×106個(gè)細(xì)胞)培養(yǎng)皿中，在37℃、5%(體積分?jǐn)?shù)，下同)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用電轉(zhuǎn)液配置一系列濃度的Gd-DO3A-INH 溶液 (2、4、6 mmol·L-1)。 將消化離心好的hMSCs分別重懸至200 μL的Gd-DO3A-INH電轉(zhuǎn)染液中，隨后轉(zhuǎn)移到96孔板中進(jìn)行脈沖電轉(zhuǎn)染標(biāo)記。將標(biāo)記好的hMSCs轉(zhuǎn)移到15 mL無菌離心管中，PBS洗滌3次，轉(zhuǎn)入100 mm×20 mm培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)、傳代,用于安全性實(shí)驗(yàn)或TEM實(shí)驗(yàn)。

1.5 Gd-DO3A-INH電轉(zhuǎn)染標(biāo)記hMSCs的安全性

Gd-DO3A-INH電轉(zhuǎn)染標(biāo)記hMSCs的安全性通過MTT試劑盒檢測標(biāo)記細(xì)胞的存活率進(jìn)行評(píng)價(jià)，基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠使外源性的MTT還原為藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這個(gè)功能。用一系列不同濃度的Gd-DO3A-INH(2、4、6 mmol·L-1)通過電轉(zhuǎn)染方法標(biāo)記hMSCs，按每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板。未經(jīng)任何處理的hMSCs以同樣的密度接種于同一個(gè)96孔板中作為對(duì)照組。等量的培養(yǎng)基加入同一96孔板中，作為空白組。將鋪有細(xì)胞的96孔板置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁密度長至80%后，每孔加入100 μL濃度為1 mg·mL-1的MTT溶液，在37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 h，緩慢吸出MTT溶液，每孔加150 μL DMSO溶液，放于搖床低速震蕩10 min。在酶標(biāo)儀490 nm處測定藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶的吸光度，以評(píng)估電轉(zhuǎn)染標(biāo)記和Gd-DO3A-INH對(duì)hMSCs的毒性。

1.6 TEM觀察Gd-DO3A-INH電轉(zhuǎn)染標(biāo)記的hMSCs

采用透射電子顯微鏡(TEM)觀察Gd-DO3A-INH電轉(zhuǎn)染標(biāo)記hMSCs 24 h后在細(xì)胞內(nèi)的分布狀態(tài)。用2.5%(V/V)戊二醛將標(biāo)記好的hMSCs在4℃固定6 h以上，用3%(w/w)的瓊脂進(jìn)行包埋，再用一系列體積分?jǐn)?shù)為 30%，50%，70%，80%，90%，100%(3次)的丙酮溶液脫水。脫水結(jié)束后，用1∶1(V/V)的包埋劑/100%丙酮浸泡細(xì)胞團(tuán)塊1 h，然后用純的環(huán)氧樹脂包埋劑浸透2 h以上。隨后放入模具中加熱至70℃聚合包埋2 d。包埋好的細(xì)胞團(tuán)塊冷卻后用超薄切片機(jī)(Leica UC6，美國)切成70 nm厚的細(xì)胞切片并負(fù)載到銅網(wǎng)支架上，用于TEM觀察。

1.7 Gd-DO3A-INH電轉(zhuǎn)染標(biāo)記hMSCs的細(xì)胞MRI

將 Gd-DOTA(商用 Dotarem，圖 1)和 Gd-DO3AINH分別電轉(zhuǎn)染標(biāo)記hMSCs并轉(zhuǎn)入100 mm×20 mm培養(yǎng)皿 (每皿約1×106個(gè)細(xì)胞)中進(jìn)行培養(yǎng)、傳代。當(dāng)細(xì)胞密度增殖到80%時(shí)，使用胰蛋白酶消化hMSCs，1 200 r·min-1離心 5 min，用 PBS 洗滌 2 次。離心所得的細(xì)胞沉淀一半用于增殖，另一半用于體外MRI。對(duì)于體外細(xì)胞MRI，將收獲的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到內(nèi)徑為1.1 mm的毛細(xì)管中，在11.7 T NMR譜儀(Bruker-Biospin，德國)上采集hMSCs沉淀的T1和T2加權(quán)圖像并測量T1和T2弛豫時(shí)間。將采集好MRI信息的hMSCs沉淀進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)后將hMSCs沉淀進(jìn)行消解至溶液清澈透明，用超純水定容至5 mL，然后用ICP-MS測定Gd含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 Gd-DO3A-INH水溶液的弛豫率

Gd-DO3A-INH的弛豫率以Gd-DOTA(r1=3.74 mmol-1·L·s-1；r2=4.85 mmol-1·L·s-1，11.7 T)作為對(duì)照。利用11.7 T NMR譜儀測量Gd-DO3A-INH溶液的縱向弛豫時(shí)間T1和橫向弛豫時(shí)間T2值，兩者的倒數(shù)1/T1和1/T2分別定義為縱向弛豫速率和橫向弛豫速率，經(jīng)線性擬合得到Gd-DO3A-INH在水溶液中的縱向弛豫率r1和橫向弛豫率r2分別為6.72和7.77 mmol-1·L·s-1(圖 2)。由于 Gd-DO3A-INH 在 Gd-DO3A的基礎(chǔ)上偶聯(lián)了苯環(huán)和異煙肼，增大了造影劑的分子量，在一定程度上提高了其縱向弛豫率r1和橫向弛豫率r2。

圖2 Gd-DO3A-INH溶液的1/T1(A)和1/T2(B)隨Gd濃度的變化Fig.2 (A)1/T1and(B)1/T2of Gd-DO3A-INH solutions as a function of Gd concentration

2.2 Gd-DO3A-INH電轉(zhuǎn)染標(biāo)記hMSCs的安全性

圖3 Gd-DO3A-INH脈沖電轉(zhuǎn)染標(biāo)記hMSCs的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 MTT assay of hMSCs labeled with Gd-DO3A-INH via electroporation

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖3)，將未標(biāo)記的對(duì)照組hMSCs的存活率設(shè)為100%，經(jīng)T-TEST方差分析，在本文實(shí)驗(yàn)條件下，脈沖電轉(zhuǎn)染過程對(duì)hMSCs的存活率與對(duì)照組無明顯差異(E0 vs Control)，電轉(zhuǎn)染過程本身對(duì)hMSCs的存活率沒有負(fù)面影響；在0～6 mmol·L-1實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，Gd-DO3A-INH電轉(zhuǎn)染標(biāo)記hMSCs，與對(duì)照組相比，標(biāo)記的hMSCs存活率隨Gd-DO3A-INH 濃度的增加略有降低(E2，E4，E6)，但均在90%以上。因此在本文實(shí)驗(yàn)條件下，Gd-DO3AINH電轉(zhuǎn)染標(biāo)記hMSCs具有較高的安全性。

2.3 Gd-DO3A-INH標(biāo)記hMSCs的細(xì)胞結(jié)合狀態(tài)

圖4 濃度為6.0 mmol·L-1的Gd-DO3A-INH電轉(zhuǎn)染標(biāo)記hMSCs的TEM圖像Fig.4 TEM images of hMSCs labeled with Gd-DO3A-INH via electroporation at 6.0 mmol·L-1

通過TEM觀察Gd-DO3A-INH在hMSCs中的聚集狀態(tài)及分布(圖4)。在TEM中清楚地觀察到在細(xì)胞質(zhì)中形成的Gd-DO3A-INH納米團(tuán)簇，納米團(tuán)簇的尺寸為數(shù)百納米到數(shù)微米，由許多納米針組成，長度為20～50 nm，直徑約為5 nm。細(xì)胞內(nèi)納米團(tuán)簇的形成過程在我們的前期工作中報(bào)道過：探針首先聚集到細(xì)胞膜表面，脈沖電轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)其在細(xì)胞膜進(jìn)一步形成納米團(tuán)簇，隨后進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中[16-17]。與此同時(shí)，在電轉(zhuǎn)染標(biāo)記過程中，一定量的游離Gd-DO3A-INH也被引入細(xì)胞質(zhì)，特別是異煙肼還具有較強(qiáng)的生物膜穿透能力，更有利于游離態(tài)的Gd-DO3A-INH進(jìn)出細(xì)胞，是本文選擇Gd-DO3A-INH作為研究對(duì)象的主因，這點(diǎn)將在MRI結(jié)果中進(jìn)一步討論。因此，電轉(zhuǎn)染將2種不同結(jié)合形式的Gd-DO3AINH引入hMSCs的細(xì)胞質(zhì)中，它們對(duì)細(xì)胞水質(zhì)子的T1和T2弛豫過程呈現(xiàn)不同的影響，并最終反映到MRI信號(hào)強(qiáng)度即對(duì)比度中。與此同時(shí)，使用Gd-DOTA和電轉(zhuǎn)染標(biāo)記細(xì)胞時(shí)，沒有觀察到納米團(tuán)簇的生成。

2.4 Gd-DO3A-INH標(biāo)記hMSCs的體外MRI

使用6 mmol·L-1的 Gd-DOTA和不同濃度的Gd-DO3A-INH(2.0、4.0、6.0 mmol·L-1)電 轉(zhuǎn) 染 標(biāo) 記hMSCs，在標(biāo)記后傳代培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)采集標(biāo)記細(xì)胞的T1和T2加權(quán)信號(hào)強(qiáng)度并測量其T1和T2弛豫速率。圖5A和B分別是Gd-DO3A-INH標(biāo)記的hMSCs的T1和T2加權(quán)像；圖6A和B分別給出Gd-DOTA和不同濃度的Gd-DO3A-INH相應(yīng)的T1和T2加權(quán)信號(hào)強(qiáng)度隨細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)間的變化；圖6C和D分別給出Gd-DOTA和不同濃度的Gd-DO3AINH相應(yīng)的T1和T2弛豫速率隨細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)間的變化。

圖5 Gd-DO3A-INH標(biāo)記hMSCs的11.7T體外(A)T1和(B)T2加權(quán)MR像Fig.5 In vitro(A)T1-and(B)T2-weighted MR images of hMSCs labeled with Gd-DO3A-INH via electroporation at 11.7 T

在T1加權(quán)像中 (圖5A)，Gd-DO3A-INH標(biāo)記的hMSCs，第0天(細(xì)胞標(biāo)記當(dāng)天)的MRI細(xì)胞影像中呈現(xiàn)出明顯的信號(hào)增強(qiáng)效應(yīng)，在2天內(nèi)呈現(xiàn)一個(gè)顯著的降低，在隨后的傳代培養(yǎng)中，信號(hào)逐漸恢復(fù)到未標(biāo)記細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度水平(定量結(jié)果見圖6A)；在圖 5B的 T2加權(quán)成像中，Gd-DO3A-INH標(biāo)記的hMSCs，T2加權(quán)成像呈現(xiàn)明顯的暗信號(hào)減弱效應(yīng)，而且標(biāo)記濃度越高，信號(hào)減弱效應(yīng)越顯著，持續(xù)的時(shí)間也更長(定量結(jié)果見圖6B)。從圖5B中可以看到，細(xì)胞內(nèi)Gd濃度隨轉(zhuǎn)染液中Gd-DO3A-INH濃度增加而增加；在隨后的細(xì)胞傳代過程中，細(xì)胞分裂及胞吐等過程導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Gd含量逐漸降低。特別值得注意的是，無論是T1加權(quán)信號(hào)還是T2加權(quán)信號(hào)，從第0天到第2天都呈現(xiàn)了一個(gè)顯著的信號(hào)突降的過程，這個(gè)過程充分反映了2種不同結(jié)合狀態(tài)Gd-DO3A-INH對(duì)細(xì)胞水質(zhì)子的T1和T2弛豫過程的不同影響機(jī)制，及其在隨后的細(xì)胞傳代培養(yǎng)過程中進(jìn)出細(xì)胞效率的不同。圖6C中Gd-DOTA的T1弛豫速率在第0天顯著加速，在隨后的3天加速效應(yīng)快速地衰減，由于Gd-DOTA電轉(zhuǎn)染標(biāo)記細(xì)胞時(shí)沒有納米團(tuán)簇生成，因此它主要反映了游離態(tài)Gd-DOTA的細(xì)胞稀釋效應(yīng)，包括細(xì)胞增殖和胞吐2個(gè)過程的貢獻(xiàn)。同樣Gd-DO3A-INH的T1弛豫速率在第0天也顯著加速，在隨后的第2天和第4天這一加速效應(yīng)快速衰減，基于其與Gd-DOTA結(jié)果的相似性，我們認(rèn)為它主要反映的也是游離態(tài)Gd-DO3A-INH的細(xì)胞稀釋效應(yīng)。由于脈沖電轉(zhuǎn)染標(biāo)記過程和異煙肼的性質(zhì)都有利于游離態(tài)Gd-DO3AINH進(jìn)入細(xì)胞，因此標(biāo)記的hMSCs在第0天含有大量的游離態(tài)Gd-DO3A-INH，呈現(xiàn)出顯著的T1加速效應(yīng)。在隨后的細(xì)胞傳代培養(yǎng)過程中，同樣由于異煙肼的穿膜性質(zhì)，游離態(tài)Gd-DO3A-INH會(huì)很快通過細(xì)胞的胞吐功能被排出細(xì)胞外，并在細(xì)胞的后續(xù)處理過程中被清除，因此傳代培養(yǎng)的細(xì)胞水質(zhì)子的T1弛豫速率快速恢復(fù)。圖6D中Gd-DO3A-INH的T2弛豫速率也顯著加速，一方面其加速的幅度遠(yuǎn)大于Gd-DOTA電轉(zhuǎn)染標(biāo)記的細(xì)胞的T2弛豫速率，另一方面，該加速效應(yīng)衰減的速度要比后者慢很多，也比其本身的T1加速效應(yīng)衰減的速度慢很多，因此我們認(rèn)為T2加速效應(yīng)主要反映的是Gd-DO3A-INH納米簇引入的局部磁場不均勻?qū)λ|(zhì)子T2弛豫過程的加速效應(yīng)；而在隨后的細(xì)胞增殖過程中，它的衰減速度要比T1加速效應(yīng)慢得多，主要反映了Gd-DO3A-INH納米簇在細(xì)胞中滯留時(shí)間長的性質(zhì)。

圖6 Gd-DOTA和不同濃度Gd-DO3A-INH電轉(zhuǎn)染標(biāo)記hMSCs的(A)T1加權(quán)信號(hào),(B)T2加權(quán)信號(hào),(C)T1弛豫速率,(D)T2弛豫速率隨傳代培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.6 (A)T1-and(B)T2-weighted MRI signal,(C)T1-and(D)T2-relaxation rates of hMSCs labeled with Gd-DOTA and Gd-DO3A-INH via electroporation at different concentration as a function of cell proliferation time

Gd-DO3A-INH通過電轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞后，一部分自組裝成數(shù)百納米到數(shù)微米的簇狀結(jié)構(gòu)分布在細(xì)胞質(zhì)中，一部分以游離態(tài)分布在細(xì)胞質(zhì)中。游離態(tài)Gd-DO3A-INH有利于加速細(xì)胞水質(zhì)子的T1弛豫速率，Gd-DO3A-INH納米團(tuán)簇有利于加速細(xì)胞水質(zhì)子的T2弛豫速率。在第0天，胞內(nèi)游離態(tài)Gd-DO3A-INH含量高，T1加速效應(yīng)在MR信號(hào)強(qiáng)度中起主導(dǎo)作用，有利于信號(hào)增強(qiáng)。在傳代培養(yǎng)2天后，大部分游離態(tài)Gd-DO3A-INH通過細(xì)胞的胞吐功能被排出細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)滯留的Gd-DO3A-INH納米粒子與水分子的接觸受到一定的限制，降低了其T1效應(yīng)，導(dǎo)致T1加速效應(yīng)在MR信號(hào)強(qiáng)度中的貢獻(xiàn)快速衰減；同時(shí)處于聚集狀態(tài)的造影劑使得細(xì)胞中的磁不均勻性顯著增加，增強(qiáng)了其T2效應(yīng)，T2加速效應(yīng)的貢獻(xiàn)突顯，有利于信號(hào)減弱。因此從第0天到第2天，出現(xiàn)T1和T2加權(quán)信號(hào)顯著衰減(圖6A和B)。在隨后的細(xì)胞傳代過程中，T2加速效應(yīng)在MR信號(hào)強(qiáng)度中起主導(dǎo)作用，且細(xì)胞中Gd-DO3A-INH納米團(tuán)簇濃度伴隨細(xì)胞傳代增殖過程逐漸降低，因此T1和T2加權(quán)信號(hào)逐漸恢復(fù)到無標(biāo)記細(xì)胞水平(圖6A和B)。

3 結(jié) 論

利用異煙肼(INH)的良好生物膜穿透性，合成了小分子MRI造影劑Gd-DO3A-INH，利用脈沖電轉(zhuǎn)染技術(shù)標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞，可以有效提高游離態(tài)Gd-DO3A-INH進(jìn)出細(xì)胞的效率，并誘導(dǎo)部分Gd-DO3A-INH在細(xì)胞質(zhì)中自組裝成納米粒子。通過細(xì)胞傳代實(shí)驗(yàn)和體外MRI清楚揭示了2種不同狀態(tài)的Gd-DO3A-INH對(duì)細(xì)胞水質(zhì)子T1和T2弛豫速率的不同影響機(jī)制：游離態(tài)Gd-DO3A-INH的T1加速效應(yīng)顯著，Gd-DO3A-INH納米團(tuán)簇的T2加速效應(yīng)顯著；在細(xì)胞傳代過程中細(xì)胞內(nèi)2種不同狀態(tài)Gd-DO3A-INH的濃度漲落引起的MRI造影效果的變化：游離態(tài)Gd-DO3A-INH在細(xì)胞標(biāo)記及隨后的傳代培養(yǎng)過程中進(jìn)出細(xì)胞效率高，T1加速效應(yīng)衰減快，Gd-DO3A-INH納米團(tuán)簇在細(xì)胞中滯留時(shí)間長，T2造影效果持續(xù)時(shí)間久。這些作用機(jī)制的揭示可以引導(dǎo)設(shè)計(jì)針對(duì)不同應(yīng)用領(lǐng)域的MRI造影劑。

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