八味龍鉆顆粒的薄層鑒別研究

陸敏靈 ，覃潔萍 ，羅宇東 ，譚紅聲 ，梁梓敏 ，郭海嬌

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠，廣西 南寧 530023）

八味龍鉆顆粒是由飛龍掌血、兩面針、大鉆、青風(fēng)藤、五指毛桃及九龍?zhí)俚劝宋端幉陌凑諌厌t(yī)藥理論合理配伍制成的顆粒劑，經(jīng)長期臨床應(yīng)用，該制劑對(duì)于風(fēng)濕性免疫系統(tǒng)疾病有較好的療效。處方中九龍?zhí)?、大鉆（又名大血藤）［1］常用于治療風(fēng)濕性免疫系統(tǒng)疾病，九龍?zhí)僦械狞S酮類成分顯示較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛抗炎活性；飛龍掌血在民間多用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［2］；青風(fēng)藤中青藤堿具有抗炎［3］、抗風(fēng)濕［4］、免疫抑制［5-6］等藥理作用；兩面針具有消腫止痛作用［7-8］；五指毛桃可以健脾益氣，化濕舒筋［9］。以上各藥材及成分均為該制劑的主要功效成分。為了更好地保證該制劑的質(zhì)量和療效，本文對(duì)該制劑中的君藥飛龍掌血、大血藤和臣藥兩面針、青風(fēng)藤、五指毛桃及九龍?zhí)俳⑵鸨由V鑒別方法，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 KQ5200超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HWS-26電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；SQP十萬分之一電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；ZF-7紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；雙槽展開缸。

1.2 試藥 甲醇、乙酸乙酯、甲酸、二甲苯、三氯甲烷、異丙醇、乙醚、乙醇、正己烷、乙酸、氨水均為分析純；硅膠G（青島海洋化工有限公司，薄層層析用）；顯色劑：磷鉬酸、碘化鉍鉀、硫酸乙醇。6批八味龍鉆顆粒（批號(hào) ：20170101、20170502、20170503、20170701、20170702、20170703）均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠提供；實(shí)驗(yàn)所有原藥材八角楓、大鉆、飛龍掌血、雞血藤、兩面針、九龍?zhí)?、五指毛桃、青風(fēng)藤均購自廣西玉林市祥生中藥飲片有限責(zé)任公司，并經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠質(zhì)量保證部李娜主管藥師鑒定；白屈菜紅堿對(duì)照品（批號(hào)：111718—201402）購自中國食品藥品檢定研究院）。

2 方法與結(jié)果

2.1 飛龍掌血的薄層鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備 稱取八味龍鉆顆粒約2 g，加乙醇40 ml，超聲處理60 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? ml溶解，作為供試品溶液。

2.1.2 飛龍掌血藥材溶液制備 取飛龍掌血粉末適量，與供試品溶液同法制備，作為飛龍掌血藥材溶液。

2.1.3 對(duì)照品溶液制備 取白屈菜紅堿對(duì)照品適量，用甲醇溶解。

2.1.4 陰性對(duì)照液制備 按處方工藝制備缺飛龍掌血和兩面針的陰性樣品，再按照供試品溶液制備方法制備，即得陰性對(duì)照液。

2.1.5 鑒別結(jié)果 照薄層色譜法（中國藥典2015年一部附錄ⅥB）［10］試驗(yàn)，吸取陰性對(duì)照液 1.5 μl、供試品溶液 1 μl、飛龍掌血藥材溶液 0.2 μl、白屈菜紅堿對(duì)照品溶液0.2 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-濃氨試液（30∶1∶0.1）為展開劑，室內(nèi)條件：T=30℃，RH=72%，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。在供試品色譜中，在與飛龍掌血藥材色譜主斑點(diǎn)相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的橙色熒光斑點(diǎn)，在與白屈菜紅堿對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙色熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照未見干擾。見圖1。

圖1 飛龍掌血的薄層鑒別圖

2.2 兩面針薄層鑒別

2.2.1 供試品溶液的制備 取八味龍鉆顆粒約2 g，加乙醇40 ml，超聲處理60 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)靡掖? ml溶解，作為供試品溶液。

2.2.2 兩面針?biāo)幉娜芤旱闹苽?取兩面針粉末適量，與供試品溶液同法制備，作為兩面針?biāo)幉娜芤骸?/p>

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 取白屈菜紅堿對(duì)照品適量，用甲醇溶解。

2.2.4 陰性對(duì)照液的制備 按處方工藝制備缺飛龍掌血和兩面針的陰性樣品，再按照供試品溶液制備方法制備，即得陰性對(duì)照液。

2.2.5 鑒別結(jié)果 照薄層色譜法［10］試驗(yàn)，吸取供試品溶液 1 μl、兩面針?biāo)幉娜芤?0.2 μl、白屈菜紅堿對(duì)照品溶液 0.5 μl、陰性對(duì)照液 1.5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，以二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液（20∶5∶3∶1∶0.1）為展開劑，室內(nèi)條件：T=30 ℃，RH=72%，預(yù)飽和10 min，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。在供試品色譜中，在與兩面針?biāo)幉纳V和白屈菜紅堿對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙色熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照未見干擾。見圖2。

圖2 兩面針的薄層鑒別圖

2.3 大鉆薄層鑒別

2.3.1 供試品溶液的制備 稱取八味龍鉆顆粒約2 g，加甲醇50 ml，超聲處理30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)舆m量2%氫氧化鈉溶解，用稀鹽酸調(diào)節(jié)濾液pH值至2，用乙醚振搖萃取3次，每次10 ml，過濾，合并乙醚液，濾液蒸干，用2 ml甲醇溶解，作為供試品溶液。

2.3.2 大鉆藥材溶液的制備 取大鉆粉末適量，與供試品溶液同法制備，作為大鉆藥材溶液。

2.3.3 陰性對(duì)照液的制備 按處方工藝制備缺雞血藤、九龍?zhí)偌按筱@的陰性樣品，再按照供試品溶液制備方法制備，即得陰性對(duì)照液。

2.3.4 鑒別結(jié)果 按照薄層色譜法［10］試驗(yàn)，精密吸取供試品溶液6μl、大鉆藥材溶液2μl、陰性對(duì)照液1.5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸（16∶1∶0.1）為展開劑，室內(nèi)條件：T=30 ℃，RH=72%，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。在供試品色譜中，在與大鉆藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照未見干擾。見圖3。

圖3 大鉆的薄層鑒別圖

2.4 青風(fēng)藤薄層鑒別

2.4.1 供試品溶液的制備 稱取八味龍鉆顆粒2 g，加無水乙醇60 ml（分2次），超聲處理2次，每次30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀柡驼〈驾腿?次，每次20 ml，正丁醇液再用水洗2次，每次20ml，合并水液，濾液蒸干，殘?jiān)脽o水乙醇2 ml溶解，作為供試品溶液。

2.4.2 青風(fēng)藤藥材溶液的制備 取青風(fēng)藤粉末適量，與供試品溶液同法制備，作為青風(fēng)藤藥材溶液。

2.4.3 青藤堿對(duì)照品溶液的制備 取青藤堿適量，用甲醇溶解。

2.4.4 陰性對(duì)照液的制備 按處方工藝制備缺青風(fēng)藤的陰性樣品，再按照供試品溶液制備方法制備，即得陰性對(duì)照液。

2.4.5 鑒別結(jié)果 按照薄層色譜法［10］，吸取供試品溶液 6 μl、青風(fēng)藤藥材溶液 2 μl、青藤堿對(duì)照品溶液 2 μl、陰性對(duì)照液3 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水（2∶4∶2∶1）10 ℃以下放置的上層溶液為展開劑，室內(nèi)條件：T=30℃，RH=72%，置濃氨試液預(yù)飽和20 min的展開缸內(nèi)展開，取出，晾干，依次噴以改良碘化鉍鉀試液。在供試品色譜中，在與青風(fēng)藤藥材及青藤堿對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同橙紅色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照未見干擾。見圖4。

圖4 青風(fēng)藤的薄層鑒別圖

2.5 五指毛桃薄層鑒別

2.5.1 供試品溶液的制備 稱取八味龍鉆顆粒2 g，加無水乙醇40 ml，超聲處理60 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇1 ml溶解，作為供試品溶液。

2.5.2 五指毛桃藥材溶液的制備 取藥材2.5 g，加乙酸乙酯25 ml，超聲處理25 min，放冷，濾過，濾液蒸干，用乙酸乙酯2 ml溶解，作為五指毛桃藥材溶液。

2.5.3 補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液的制備 取補(bǔ)骨脂素適量，用甲醇溶解。

2.5.4 陰性對(duì)照液的制備 按處方工藝制備缺五指毛桃的陰性樣品，再按照供試品溶液制備方法制備，作為陰性對(duì)照液。

2.5.5 鑒別結(jié)果 按照薄層色譜法［10］試驗(yàn)，吸取供試品溶液 6 μl、五指毛桃藥材溶液 2 μl、補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液 1 μl、陰性對(duì)照液 1 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠 G 薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（8∶2）為展開劑，室內(nèi)條件：T=30℃，RH=72%，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。在供試品色譜中，在與五指毛桃藥材色譜和補(bǔ)骨脂素對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照未見干擾。見圖5。

圖5 五指毛桃的薄層鑒別圖

2.6 九龍?zhí)俦予b別

2.6.1 供試品溶液的制備 稱取八味龍鉆顆粒1.0 g，加三氯甲烷-甲醇（8∶2）10 ml，振蕩 20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml溶解，作為供試品溶液。

2.6.2 九龍?zhí)偎幉娜芤旱闹苽?取藥材1 g，加三氯甲烷-甲醇（8∶2）10 ml，振蕩 20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml溶解，作為九龍?zhí)偎幉娜芤骸?/p>

2.6.3 陰性對(duì)照液的制備 按處方工藝制備缺九龍?zhí)?、雞血藤和大鉆的陰性樣品，再按照供試品溶液制備方法制備，作為陰性對(duì)照液。

2.6.4 鑒別結(jié)果 按照薄層色譜法［10］試驗(yàn)，吸取供試品溶液 6 μl、九龍?zhí)偎幉娜芤?0.5 μl、陰性對(duì)照液 1 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60°～90°）-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（7.5∶4∶1.5∶0.75）為展開劑，室內(nèi)條件：T=30℃，RH=72%，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。在供試品色譜中，在與九龍?zhí)偎幉纳V相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照未見干擾。見圖6。

圖6 九龍?zhí)俚谋予b別圖

3 討 論

3.1 對(duì)照品的選擇 飛龍掌血與兩面針?biāo)幉牡闹饕钚猿煞譃榘浊思t堿和氯化兩面針堿，故在這兩個(gè)藥材TLC鑒別條件摸索時(shí)，曾嘗試使用白屈菜紅堿和氯化兩面針堿共同作為參照物進(jìn)行顆粒與藥材的鑒別，但由于該制劑顆粒中氯化兩面針堿含量不穩(wěn)定，多個(gè)批次樣品氯化兩面針堿的斑點(diǎn)無法清晰的展現(xiàn)，故確定在該制劑的飛龍掌血與兩面針TLC鑒別中僅采用白屈菜紅堿作為對(duì)照指標(biāo)性成分。青藤堿為青風(fēng)藤指標(biāo)性成分，補(bǔ)骨脂素為五指毛桃指標(biāo)性成分，故分別作為這兩個(gè)藥材鑒別的對(duì)照指標(biāo)性成分。大鉆、九龍?zhí)偎幉挠捎谠陬w粒中共有成分較多，沒找到合適的對(duì)照指標(biāo)成分，故本實(shí)驗(yàn)僅使用對(duì)照藥材進(jìn)行鑒別，沒有選擇單一成分對(duì)照品作為鑒別指標(biāo)。

3.2 溫濕度的考察 在考察實(shí)驗(yàn)條件時(shí)，分別對(duì)飛龍掌血、兩面針、大鉆、青風(fēng)藤、五指毛桃及九龍?zhí)俑魉幉牡腡LC展開溫濕度進(jìn)行了考察。分別考察了溫度4～10℃、30℃及相對(duì)濕度32%、72%的影響，結(jié)果顯示溫度對(duì)六味藥材的分離效果均無顯著影響，但在相對(duì)濕度32%下對(duì)飛龍掌血影響較大，對(duì)其它藥材均無影響。

3.3 展開劑的考察 飛龍掌血考察了三氯甲烷-甲醇-濃氨試液（30∶1∶0.1）、三氯甲烷-甲醇（25∶1）和三氯甲烷-甲醇-濃氨試液（30∶3∶0.2）這三個(gè)展開系統(tǒng)，分離效果均較好，經(jīng)過比較之后選擇三氯甲烷-甲醇-濃氨試液（30∶1∶0.1）為飛龍掌血的展開劑。兩面針考察了二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液 （20∶5∶3∶1∶0.1）、環(huán)己烷-醋酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液（20∶5∶3∶1∶0.1） 和環(huán)己烷-醋酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液（15∶10∶3∶1∶0.1），三種展開系統(tǒng)分離效果均較好，但二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液（20∶5∶3∶1∶0.1）展開系統(tǒng)有適宜的比移值，因此選用其為兩面針的展開劑。大鉆考察了乙酸乙酯-丙酮-甲酸（16∶5∶0.1）、三氯甲烷-丙酮-甲酸（16∶5∶0.1）和三氯甲烷-丙酮-甲酸（16∶1∶0.1）這三種展開系統(tǒng)，都可以將有效成分分離，但三氯甲烷-丙酮-甲酸（16∶1∶0.1）分離的斑點(diǎn)較明顯，比移值較好，所以選用其為大鉆的展開劑。青風(fēng)藤按照薄層色譜法（中國藥典2015年版一部附錄VIB）試驗(yàn)中展開系統(tǒng)甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水（2∶4∶2∶1），由于甲苯毒性較大，用極性相近的有機(jī)溶劑二甲苯替換，如氯仿、二氯甲烷、二甲苯等，但氯仿及二氯甲烷與其他展開劑分層不明顯，二甲苯的展開系統(tǒng)分離效果較好，能明顯將成分分離出來，選擇考察了二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水（2∶4∶2∶1）、氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水（2∶4∶2∶1）和二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水（4∶4∶2∶1）展開系統(tǒng)，均能分離，但二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水（2∶4∶2∶1）不會(huì)形成二次展開，所以選擇其作為青風(fēng)藤展開系統(tǒng)。五指毛桃選擇正己烷-乙酸乙酯（8∶2）、環(huán)己烷-氯仿（8∶2）、甲苯-乙酸乙酯（7∶3）、正己烷-乙酸乙酯（10∶2）及正己烷-乙酸乙酯（10∶5）五種展開系統(tǒng)考察，正己烷-乙酸乙酯（8∶2）能充分將成分分離，故選擇其為五指毛桃的展開系統(tǒng)。九龍?zhí)倏疾焓兔眩?0°～90°）-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（7.5∶4∶1.5∶0.75）、石油醚（60 °～90 °）-環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇（7.5∶4∶1.5∶0.75）和石油醚（60 °～90 °）-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（7.5∶2∶1.5∶0.75）三種展開系統(tǒng)，比較了這三種展開系統(tǒng)，石油醚（60°～90°）-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（7.5∶4∶1.5∶0.75）這個(gè)系統(tǒng)可以將有效成分分離，確定其為九龍?zhí)俚恼归_系統(tǒng)。為了增加本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信度，避免誤差，本實(shí)驗(yàn)選擇了6個(gè)批次的八味龍鉆顆粒作為供試品。

八味龍鉆顆粒作為復(fù)方中藥制劑，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)單單只對(duì)某一類化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行理化鑒別，專屬性不強(qiáng)，為了更加準(zhǔn)確地控制其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)在原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上增加了對(duì)制劑中飛龍掌血、兩面針、大鉆、青風(fēng)藤、五指毛桃及九龍?zhí)倭端幉牡蔫b別，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本文建立的方法專屬性強(qiáng)，穩(wěn)定性及重現(xiàn)性好。本研究為八味龍鉆顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和方法依據(jù)。本文建立八味龍鉆顆粒的薄層鑒別法（TLC法），在主要成分的鑒別中，6批八味龍鉆顆粒溶液的特征斑點(diǎn)與六味藥材以及對(duì)照品的特征斑點(diǎn)顏色一致、大小相同且斑點(diǎn)清晰。薄層色譜專屬性強(qiáng)，分離效果好，操作簡便，重現(xiàn)性好，結(jié)果可靠，能較好地控制八味龍鉆顆粒的質(zhì)量。