黃芪水煎劑對(duì)IR損傷大鼠腎小管細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制分析

周 刊，呂冬寧，陶志虎

（1.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530201；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530022）

腎小管壞死的主要原因是腎缺血再灌注損傷（ischemic reperfusion，IR），并由此導(dǎo)致臨床急性腎損傷（AKI），在腎缺血再灌注損傷時(shí)腎小管上皮細(xì)胞凋亡過程的作用非常關(guān)鍵。細(xì)胞凋亡的影響因素非常多，其中Bcl-2家族基因是非常關(guān)鍵性的影響因素，能在很大程度調(diào)控腎IR損傷細(xì)胞凋亡。專家提出中藥黃芪能夠在一定程度上保護(hù)腎IR損傷，但其作用機(jī)制尚未明確［1-2］。本研究擬分析黃芪水煎劑（AE）對(duì)急性IR損傷大鼠腎小管細(xì)胞凋亡與Bcl-2、Bax表達(dá)的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及用材 ①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：從廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購進(jìn)雄性健康SD大鼠［合格證號(hào)：SCXK（桂）2005-0001］30 只，體質(zhì)量 200～220 g，大鼠喂養(yǎng)地點(diǎn)是廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。②藥物：黃芪生藥水煎劑（濃度：0.2 g/ml）。③試劑：原位細(xì)胞凋亡（TUNEL）檢測試劑盒（廣西博士德生物工程有限公司）；DAB顯色試劑盒及Trizol試劑（USA Invitrogen公司）；HRP標(biāo)記的二抗、兔抗大鼠Bcl-2、兔抗β-actin、Bax單克隆抗體（USA Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組 30只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)組、缺血再灌注損傷（IR）組和AE預(yù)處理組。

1.2.2 給藥 在手術(shù)前3 d，AE預(yù)處理組給予黃芪水煎劑，經(jīng)腹腔注射給藥（0.2 g/ml/kg），每天1次，共3 d。假手術(shù)組與IR組經(jīng)腹腔注射給予等量生理鹽水。三組在最后一次給藥（或生理鹽水）后4 h予手術(shù)造模［3］。

1.2.3 造模與取材 三組選用麻醉注射劑為戊巴比妥鈉（45 mg/kg），經(jīng)腹腔注入，在腹正中部位制造創(chuàng)面，將雙側(cè)腎臟充分暴露，IR組、AE預(yù)處理組使用無損動(dòng)脈夾將雙側(cè)腎動(dòng)脈夾緊，維持45 min后松開無損傷動(dòng)脈夾，恢復(fù)灌注狀態(tài)，能夠觀察到腎臟顏色從暗紅轉(zhuǎn)至鮮紅，提示灌注順利，之后縫合切口［4］。假手術(shù)組只將雙側(cè)腎臟處于游離狀態(tài)，并且進(jìn)行1 h的暴露，再將腹腔切口縫合。三組手術(shù)結(jié)束6 h后進(jìn)行第2次麻醉操作，將左腎摘除，予4%甲醛固定部分腎組織，固定維持1 d后用酒精按一定濃度梯度順序脫水、石蠟包埋；另外剩余腎組織即時(shí)存儲(chǔ)在液氮內(nèi)，凍透之后存儲(chǔ)條件為-80℃，以備RNA及蛋白質(zhì)的提取檢測［5］。

1.2.4 檢測指標(biāo) ①腎組織caspase-3、caspase-8和caspase-9活性：采用熒光試劑盒檢測。②腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)：腎小管細(xì)胞凋亡率（%）為腎小管上皮凋亡陽性細(xì)胞數(shù)在腎小管總細(xì)胞數(shù)中的所占比例［6］。③腎組織Bax、Bcl-2表達(dá)：采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以“±s”表示，采用 t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況比較 假手術(shù)組大鼠腎組織中極少見到凋亡細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率為（2.91±0.41）%；IR 組腎小管上皮細(xì)胞凋亡率為（39.52±6.33）%，明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），凋亡細(xì)胞主要集中在皮髓質(zhì)交界和髓質(zhì)；AE預(yù)處理組腎組織細(xì)胞凋亡率為（19.47±5.75）%，顯著低于IR組（P＜0.05）。

2.2 三組大鼠腎組織Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2和Fas表達(dá)情況比較 見表1、圖1。

2.3 三組大鼠腎組織caspase-3、caspase-8和caspase-9表達(dá)情況比較 見表2、圖2。

表1 三組大鼠腎組織Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2和Fas表達(dá)值比較 （±s）

表1 三組大鼠腎組織Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2和Fas表達(dá)值比較 （±s）

注：與假手術(shù)組相比，①P＜0.05；與 IR 組相比，②P＜0.05，下表同

組 別 n Bax（g/kg）Bcl-2（g/kg）Bax/Bcl-2 Fas（g/kg）假手術(shù)組 10 0.24±0.05 0.39±0.05 0.62±0.09 0.40±0.08 IR 組 10 0.71±0.29① 0.51±0.13① 1.35±0.19① 0.25±0.26①AE預(yù)處理組 10 0.51±0.14② 0.65±0.16② 0.81±0.15② 0.12±0.09②

圖1 三組大鼠腎組織Bax、Bcl-2和Fas的表達(dá)情況

3 討論

在手術(shù)過程中常常會(huì)出現(xiàn)腎IR損傷的癥狀，極有可能會(huì)誘發(fā)急性腎損傷（AKI），甚至?xí)沟没颊邌适I功能，其中損傷最快的是腎小管上皮細(xì)胞，臨床上相關(guān)研究提出腎IR損傷的關(guān)鍵性途徑就是腎小管上皮細(xì)胞凋亡，所以，研究出抑制腎小管細(xì)胞凋亡的方法對(duì)AKI的預(yù)防來說具備臨床價(jià)值［7-8］。AE可以憑借對(duì)IR大鼠Bax/Bcl-2基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，對(duì)IR損傷大鼠腎小管細(xì)胞凋亡的整個(gè)過程形成制約作用，進(jìn)而使得腎缺血再灌注損傷得到糾正。

表2 三組大鼠腎組織caspase-3、caspase-8和caspase-9 表達(dá)情況比較 （±s）

表2 三組大鼠腎組織caspase-3、caspase-8和caspase-9 表達(dá)情況比較 （±s）

組 別 n caspase-3（μM）caspase-8（μM）caspase-9（μM）假手術(shù)組 10 0.39±0.07 0.33±0.05 0.43±0.08 IR 組 10 0.77±0.14① 0.93±0.15① 0.90±0.13①AE 預(yù)處理組 10 0.59±0.08② 0.61±0.08② 0.63±0.11②

圖2 三組大鼠腎組織caspase-3、caspase-8和caspase-9蛋白質(zhì)表達(dá)情況

本研究數(shù)據(jù)顯示腎缺血再灌注操作進(jìn)行之后會(huì)顯著增加腎小管細(xì)胞凋亡的總數(shù)，這與既往研究相符。細(xì)胞凋亡包括：線粒體途徑，其中調(diào)控基因主要是抗凋亡基因Bcl-2、促凋亡基因Bax，兩種基因?qū)嶋H比例會(huì)對(duì)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的形成產(chǎn)生較大影響［9］；死亡受體途徑，死亡受體例如Fa-L和Fas結(jié)合之后，就會(huì)使得下游分子活化，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。上述兩種方式都會(huì)使得Caspase活化，加速細(xì)胞凋亡。缺血性損傷之后細(xì)胞死亡的關(guān)鍵性模式就是凋亡，細(xì)胞凋亡的調(diào)控影響因素包括多種有關(guān)基因與對(duì)應(yīng)的蛋白，基因主要包括抗凋亡基因與促凋亡基因［10］。近些年的報(bào)道中提出，Bcl-2與Bax是一種調(diào)控分子，嚴(yán)重影響腎缺血再灌注過程中細(xì)胞的存在狀態(tài)，Bcl-2的影響程度最大，Bcl-2表達(dá)程度過高或Bcl-2/Bax比例提高都會(huì)使得Bax的表達(dá)受到制約，進(jìn)而使得細(xì)胞凋亡過程被抑制，這種抑制的機(jī)理主要有以下幾種可能：（1）對(duì)pr-ICE到ICE的轉(zhuǎn)化過程形成制約，對(duì)促細(xì)胞凋亡基因信號(hào)的傳達(dá)產(chǎn)生阻隔作用，或是使得相關(guān)基因失效［11］；（2）細(xì)胞器Ca2+內(nèi)流出現(xiàn)變化，進(jìn)而使得凋亡過程受到阻礙；（3）對(duì)氧自由基產(chǎn)生制約，體現(xiàn)為抗細(xì)胞凋亡效應(yīng)；（4）和raf-1結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞增殖，對(duì)凋亡產(chǎn)生抑制作用。增強(qiáng)Bax表達(dá)之后，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔將處于開放狀態(tài)，進(jìn)而使得胞質(zhì)內(nèi)引入大量的細(xì)胞色素C，促進(jìn)凋亡［12］。簡而言之，Bax表達(dá)強(qiáng)化，會(huì)促進(jìn)凋亡；Bcl-2表達(dá)強(qiáng)化，能制約凋亡，Bax/Bcl-2表達(dá)的平衡狀態(tài)會(huì)在很大程度上影響細(xì)胞存在狀態(tài)，其比值提高會(huì)促進(jìn)凋亡，比值減小會(huì)抑制凋亡［13］。根據(jù)本研究結(jié)果得知，IR環(huán)節(jié)中細(xì)胞凋亡指數(shù)能夠因?yàn)锳E預(yù)處理的進(jìn)行而減小，進(jìn)而使得Bax mRNA、Bcl-2 mRNA的表達(dá)分別得到抑制、強(qiáng)化，Bax/Bcl-2比例也會(huì)因此減小，并且表現(xiàn)出顯著的劑量依賴性，這就表明黃芪可以對(duì)凋亡相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)節(jié)，使得Bax/Bcl-2比例出現(xiàn)改變，并因此讓比例趨近于1，對(duì)caspase3的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而避免出現(xiàn)腎小管細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，降低缺血性ARF的發(fā)生率［14］。

黃芪具有斂瘡生肌、補(bǔ)氣固表、排膿、利尿托毒的功效，常作為補(bǔ)益藥運(yùn)用于臨床治療中，適用于血虛、瘀、氣虛等證候。腎缺血再灌注損傷表現(xiàn)為典型的氣血虛弱、瘀血阻滯證候，運(yùn)用黃芪有利于改善腎組織再灌注后損傷、降低鈉排泄分?jǐn)?shù)提高程度，對(duì)IR大鼠腎小管細(xì)胞凋亡產(chǎn)生顯著抑制作用，其作用機(jī)理可能與其對(duì)Bcl-2、Bax表達(dá)的調(diào)節(jié)有較大關(guān)系［15］。同時(shí)，細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)與其他復(fù)雜的機(jī)理也存在關(guān)系，黃芪水煎劑對(duì)腎小管細(xì)胞凋亡的制約效應(yīng)和抗氧化效果的機(jī)理有待今后進(jìn)一步研究，進(jìn)而為臨床運(yùn)用黃芪進(jìn)行缺血性AKI的防治提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。