綠茶糖苷類(lèi)黃酮對(duì)酒精肝纖維化小鼠肝組織及肝功能的影響

陳潔靜，段雪琳，徐培康，黃遠(yuǎn)爐，袁麗蘭，王 琳

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

近幾年，肝硬化死亡的人數(shù)不斷上升，其中長(zhǎng)期慢性的膽汁淤積造成的膽汁性肝硬化占主要原因［1］。研究表明，肝纖維化、早期肝硬化通過(guò)臨床有效干預(yù)是可以達(dá)到完全逆轉(zhuǎn)的［2-4］。中醫(yī)藥在肝纖維化的治療上積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，具有療效顯著、副作用少等優(yōu)勢(shì)［5-8］。綠茶中的有效成分糖苷類(lèi)黃酮能有效減少多個(gè)炎癥介質(zhì)的表達(dá)，從而減輕半乳糖胺所致的大鼠肝損傷［9］，但其能否改善肝纖維化尚未見(jiàn)有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究綠茶糖苷類(lèi)黃酮對(duì)酒精肝纖維化小鼠肝組織及肝功能的影響，探索綠茶糖苷類(lèi)黃酮在延緩肝纖維化中可能存在的機(jī)制，為防治肝纖維化的藥物開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)小鼠60只，雄性，體質(zhì)量20±5 g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證號(hào)：SCXK桂2009-0002）。

1.2 試劑 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒（南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號(hào)：20170705）；95%酒精（成都科龍化學(xué)試劑廠，生產(chǎn)批號(hào)：2017012201）；秋水仙堿（西雙版納版納藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H53021369）。

1.3 試藥 綠茶為市售品，參照文獻(xiàn)［10］提取綠茶糖苷類(lèi)黃酮。將綠茶剪碎，加適量蒸餾水浸泡0.5 h后煎煮1h，過(guò)濾，取茶渣加適量水再次提取1h。將兩次綠茶水煮液合并，水浴濃縮。在濃縮液中加入95%酒精適量，使含醇量達(dá)80%，靜置數(shù)小時(shí)，取上清液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行減壓濃縮，回收溶劑加入沉淀物，攪拌靜置。多次重復(fù)上述步驟，直至上清液的顏色明顯變淡。取濃縮上清液浸膏加適量水溶解，濕法上樣，過(guò)D101大孔樹(shù)脂，分別用水和30%、50%、70%的酒精依次洗脫，收集30%、50%、70%酒精流份，再用80%酒精通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回流提取減壓濃縮。取濃縮液，充分干燥后粉碎成粉末狀，備用。粉末經(jīng)檢測(cè)為黃酮類(lèi)化合物，經(jīng)定量分析，得到黃酮含量為847 g/kg，用時(shí)以蒸餾水稀釋為4.24 mg/L、10.59 mg/L、21.18 mg/L 的濃度。

2 方法

2.1 分組與造模 將60只小鼠隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組、模型組、秋水仙堿組及綠茶糖苷類(lèi)黃酮低、中、高劑量組。除正常對(duì)照組外，余組動(dòng)物每天灌胃給予50%酒精5 ml，連續(xù)灌胃4周，制作肝纖維化模型。正常對(duì)照組小鼠灌胃給予生理鹽水5 ml，連續(xù)灌胃4周。末次灌胃后24 h，隨機(jī)從各組抽取2只小鼠，統(tǒng)一采集小鼠肝左葉上緣，HE染色后鏡下觀察，以小鼠肝組織有不同程度的炎細(xì)胞浸潤(rùn)、假小葉形成和肝纖維化為酒精肝纖維化造模成功。

2.2 給藥干預(yù) 第5～8周，秋水仙堿組按0.15 mg/kg灌胃給予秋水仙堿，灌胃容量為5 ml/d；綠茶糖苷類(lèi)黃酮低、中、高劑量組分別按 1 mg/kg、2.5 mg/kg、5 mg/kg灌胃給予綠茶糖苷類(lèi)黃酮，灌胃容量為5 ml/d；正常對(duì)照組和模型組灌胃給予等量生理鹽水。每組均于每天18∶00～19∶00 給藥干預(yù) 1 次，常規(guī)飲水喂養(yǎng)，其他實(shí)驗(yàn)條件相同。

2.3 樣本采集與處理 末次給藥后24 h，將小鼠固定，眼眶采血后處死，采集小鼠肝左葉上緣。取小鼠的眼球血，3 000 r/min連續(xù)高速離心15 min，取離心上層血清。再以微孔濾膜（0.22 μm）過(guò)濾除菌，置于-20℃的冰箱儲(chǔ)備。應(yīng)用722-分光光度計(jì)檢測(cè)各組小鼠血清吸光度，依照ALT試劑盒說(shuō)明書(shū)，計(jì)算出小鼠肝功能指標(biāo)ALT數(shù)值。取小鼠肝臟左葉上緣組織，固定、脫水、包埋、切片，在HE染色顯微鏡下觀察小鼠肝組織的形態(tài)、病理變化，并對(duì)小鼠肝纖維化程度進(jìn)行評(píng)分、分期。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況 死亡小鼠：實(shí)驗(yàn)中共有6只小鼠死亡，其中正常對(duì)照組2只，模型組3只，綠茶糖苷類(lèi)黃酮中劑量組1只。行尸檢、病理分析，模型組3只死于急性肝衰竭，正常對(duì)照組2只和綠茶糖苷類(lèi)黃酮中劑量組1只為灌胃過(guò)程中小鼠突發(fā)急性窒息，以上小鼠不納入統(tǒng)計(jì)。存活小鼠一般狀態(tài)觀察：正常對(duì)照組、秋水仙堿組、綠茶糖苷類(lèi)黃酮高劑量組小鼠精神良好、毛發(fā)光滑、反應(yīng)靈敏；模型組精神萎靡、毛發(fā)粗糙、好靜；綠茶糖苷類(lèi)黃酮低、中劑量組介于上述兩者之間。肝臟大體標(biāo)本顯示：正常對(duì)照組、秋水仙堿組、綠茶糖苷類(lèi)黃酮高劑量組小鼠肝臟大小適宜、色澤紅潤(rùn)，質(zhì)軟；模型組色暗沉，質(zhì)稍韌，表面較粗糙，形體偏?。痪G茶糖苷類(lèi)黃酮低、中劑量組則介于上述兩者之間。

3.2 各組小鼠ALT水平比較 見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清ALT水平比較 （±s）

表1 各組小鼠血清ALT水平比較 （±s）

注：與正常對(duì)照組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01；與綠茶糖苷類(lèi)黃酮高劑量組比較，③P＜0.05

組 別 n 劑量（mg/kg）小鼠血清ALT（U/L）正常對(duì)照組 6 — 22.88±4.57模型組 5 — 88.93±4.22①秋水仙堿組 8 0.15 49.34±3.42②綠茶糖苷類(lèi)黃酮低劑量組 8 1 63.70±2.16②③綠茶糖苷類(lèi)黃酮中劑量組 7 2.5 59.40±2.77②③綠茶糖苷類(lèi)黃酮高劑量組 8 5 54.21±18.09②

表1結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清ALT水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各用藥組小鼠血清ALT水平顯著降低（P＜0.01）；與綠茶糖苷類(lèi)黃酮高劑量組比較，綠茶糖苷類(lèi)黃酮低、中劑量組血清ALT水平有顯著性差異（P＜0.05），呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。

3.3 各組小鼠肝臟病理學(xué)比較

3.3.1 各組小鼠肝組織病理學(xué)觀察 見(jiàn)圖1。正常對(duì)照組：肝組織未見(jiàn)明顯異常；模型組：匯管區(qū)膠原結(jié)締組織增生，小膽管增生，可見(jiàn)橋接纖維化，有大量肝細(xì)胞脂肪變，中央靜脈周?chē)渭?xì)胞內(nèi)和小膽管內(nèi)可見(jiàn)淤積膽汁；秋水仙堿組和綠茶糖苷類(lèi)黃酮高劑量組：小葉結(jié)構(gòu)基本存在，肝細(xì)胞脂肪變，膠原纖維增生，竇周纖維化；綠茶糖苷類(lèi)黃酮低、中劑量組：匯管區(qū)纖維增生，肝細(xì)胞脂肪變。

圖1 各組小鼠肝組織病理切片（×400）

3.3.2 各組肝組織病理Ishak評(píng)分比較 按文獻(xiàn)［11］進(jìn)行肝纖維化Ishak評(píng)分。0分：無(wú)纖維增生；1分：有部分纖維增生，纖維隔膜少或無(wú)；2分：有較多的纖維增生，纖維隔膜有或無(wú)；3分：有較多的纖維增生，纖維橋連偶見(jiàn)；4分：有較多纖維增生，纖維橋連明顯；5分：明顯的橋連，偶見(jiàn)不完全硬化性結(jié)節(jié)；6分：明確或可能有肝硬化。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2結(jié)果顯示，與模型組比較，各用藥組肝纖維化Ishak評(píng)分顯著下降（P＜0.01），表明綠茶糖苷類(lèi)黃酮對(duì)改善肝纖維化有一定作用。

表2 各組小鼠肝纖維化Ishak評(píng)分比較 （±s）

表2 各組小鼠肝纖維化Ishak評(píng)分比較 （±s）

注：與模型組比較，①P＜0.01

組 別 n 劑量（mg/kg）肝纖維化Ishak評(píng)分（分）正常對(duì)照組 6 — 0模型組 5 — 5.80±0.45秋水仙堿組 8 0.15 0.38±0.52①綠茶糖苷類(lèi)黃酮低劑量組 8 1 1.75±1.39①綠茶糖苷類(lèi)黃酮中劑量組 7 2.5 0.86±0.69①綠茶糖苷類(lèi)黃酮高劑量組 8 5 0.63±0.52①

4 討論

肝纖維化是以大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積為主要病理特征的一種代償性損傷愈合反應(yīng)，肝纖維化嚴(yán)重時(shí)可以轉(zhuǎn)變成肝硬化［12-14］，肝纖維化患者或無(wú)明顯臨床癥狀，或表現(xiàn)出食欲減退、全身乏力、消化不良、不明原因出血等非特異性臨床表現(xiàn)，常不能引起患者的重視，大多數(shù)在體檢時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)。山茶科草本植物綠茶，其主要成分糖苷類(lèi)黃酮可減輕肝損傷，減少炎癥介質(zhì)的表達(dá)［9］，本課題組推測(cè)其在肝纖維化的改善上也具有一定的作用。

本實(shí)驗(yàn)采用綠茶糖苷類(lèi)黃酮干預(yù)酒精所致肝纖維化小鼠，以秋水仙堿為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果顯示，與模型組比較，綠茶糖苷類(lèi)黃酮低、中、高劑量組小鼠一般情況，如精神狀況、食欲、毛發(fā)色澤等良好。肉眼肝臟大體標(biāo)本見(jiàn)肝色鮮艷、質(zhì)軟，形態(tài)大小適宜。HE染色鏡下示肝病變程度均有所降低。ALT作為肝功能檢測(cè)的最敏感指標(biāo)，當(dāng)肝細(xì)胞出現(xiàn)1%損傷，血清中的ALT水平便可達(dá)到正常水平1倍以上［15］。ALT可獨(dú)立反映肝病發(fā)展程度，與肝組織病變密切關(guān)聯(lián)。本文研究表明，與模型組比較，綠茶糖苷類(lèi)黃酮低、中、高劑量組小鼠血清ALT表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01），呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系；且肝纖維化Ishak評(píng)分也顯著下降（P＜0.01）。以上結(jié)果提示，綠茶糖苷類(lèi)黃酮對(duì)酒精肝纖維化在護(hù)肝、改善肝纖維化上有一定的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與部分已有文獻(xiàn)結(jié)論相吻合，由于僅作為初步的探索，尚存在檢測(cè)指標(biāo)較少、實(shí)驗(yàn)小鼠數(shù)量不足等缺陷，下一步還應(yīng)加大研究深度，探討其作用機(jī)制及潛在靶點(diǎn)，進(jìn)一步明確綠茶糖苷類(lèi)黃酮對(duì)肝纖維化的作用，為肝纖維化防治研究提供參考數(shù)據(jù)。