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1.內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院,內(nèi)蒙古 通遼 028000;2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院, 內(nèi)蒙古 通遼 028000;3.內(nèi)蒙古自治區(qū)庫(kù)倫旗蒙醫(yī)醫(yī)院,內(nèi)蒙古 庫(kù)倫旗 028000
棘豆止咳散為內(nèi)蒙古通遼市庫(kù)倫旗蒙醫(yī)醫(yī)院的醫(yī)院制劑,由甘草、川貝母、多葉棘豆、石膏4味藥組成。其中,葉棘豆為君藥、川貝母為臣藥、甘草為使藥、石膏為佐藥,該藥對(duì)于多種咳嗽均具有明顯療效,老人和兒童均可使用[1]。甘草作為其中一味重要組成藥味,為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根莖[2]。甘草自古以來(lái)就作為鎮(zhèn)咳藥廣泛應(yīng)用[3-4]。甘草中含有皂苷和黃酮兩大類(lèi)成分[5-6],已有研究表明黃酮類(lèi)成分具有顯著的鎮(zhèn)咳作用[7-8]。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法對(duì)棘豆止咳散中藥效成分甘草苷的含量進(jìn)行了測(cè)定,并進(jìn)行了方法學(xué)考察。
1.1 儀器 LC-20AT 手動(dòng)高效液相色譜儀(島津);BS224 S分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);FW-177高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司);HW-526數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海恒科學(xué)儀器有限公司)。
1.2 材料 95%乙醇(天津市永大化學(xué)有限公司);乙腈為色譜純,水為超純水,其他試劑均為分析純。多葉棘豆(批號(hào):1807046)、甘草(批號(hào):170628)、川貝母(批號(hào):1701036)、生石膏(批號(hào):1703067)等藥材均由赤峰榮興堂藥業(yè)有限責(zé)任公司蒙中藥飲片廠提供;甘草苷對(duì)照品(批號(hào):111610-201607,中國(guó)食品藥品檢定研究院)。
2.1 色譜條件 色譜柱:X Terra MSC18(4.6 mm×250 mm,5.0 μm);流動(dòng)性:A相為乙腈,B相為0.05%磷酸水,按表1規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng):237 nm;柱溫:40℃;流速:1.0 mL/min;檢測(cè)時(shí)間:40 min;進(jìn)樣量:10 μL。在上述條件下,供試品溶液中甘草苷的吸收峰與其他相關(guān)峰均能達(dá)到較好分離,分離度大于1.5,理論塔板數(shù)以甘草苷計(jì)不低于2000。按棘豆止咳散處方制備工藝自制不含甘草藥材的陰性供試品溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣,結(jié)果陰性供試品溶液對(duì)樣品測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖如圖1所示。
表1 流動(dòng)性梯度洗脫表
2.2 溶液的制備
2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取甘草苷對(duì)照品,精密稱(chēng)定,加70%乙醇制成每1 mL含甘草苷0.1 mg的溶液,即得。
2.2.2 供試品溶液的制備 取由甘草、川貝母、多葉棘豆、石膏(2∶1∶2∶1)比例制備的散劑粉末(過(guò)100目篩)約0.5 g,精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇30 mL,密塞,稱(chēng)定重量,超聲處理30 min,放冷,再稱(chēng)定重量,用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,過(guò)濾,取續(xù)濾液,即得。
2.3 線性關(guān)系考察 精密稱(chēng)量甘草苷對(duì)照品1.08 mg定容于10 mL容量瓶中,加70%乙醇溶液使其溶解,并稀釋至刻度,得其甘草苷濃度為0.108 mg/mL。分別精密吸取5、7.5、10、12.5、15 μL,注入液相色譜儀,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)下表2,以對(duì)照品吸收峰面積為縱坐標(biāo)Y,進(jìn)樣量(μL)為橫坐標(biāo)X,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖2所示。
表2 甘草苷線性關(guān)系考察
其中R2=0.9993,說(shuō)明甘草苷在該范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。
2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液,同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6針,精密吸取10 μL,注入高效液相色譜儀,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)下表,根據(jù)其峰面積計(jì)算其RSD值為0.502%,表明該儀器精密度良好,見(jiàn)表3。
表3 精密度實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果
2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)量取同一批棘豆止咳散散劑粉末6份,分別按照“2.2.2”供試品溶液制備方法制備,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6針,精密吸取10 μL,注入高效液相色譜儀測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)下表,根據(jù)其峰面積計(jì)算其RSD值為0.632%,表明方法重復(fù)性良好。見(jiàn)表4。
表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果
2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,精密稱(chēng)取同一批棘豆止咳散散劑粉末一份,按照“2.2.2”供試品溶液制備方法制備,分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣,精密吸取10 μL,注入高效液相色譜儀測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表5,根據(jù)其峰面積計(jì)算其RSD值為2.849%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
2.7 回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)量甘草苷對(duì)照品10.06 mg定容于10 mL容量瓶中,加70%乙醇溶液使其溶解,并稀釋至刻度,得其甘草苷濃度為1.006 mg/mL。精密稱(chēng)取同一批棘豆止咳散散劑粉末9份,每份0.25 g左右,在其中加入甘草苷對(duì)照品0.5 mL、1 mL、1.5 mL每組三份,共九份。按照“2.2.2”供試品溶液制備方法制備,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,精密吸取10 μL,注入高效液相色譜儀測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表6,根據(jù)其回收率計(jì)算其RSD值為2.968%。
2.8 樣品測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL,注入高效液相色譜儀測(cè)定,計(jì)算得到棘豆止咳散散劑中甘草苷的含量為0.3526%。
《傳統(tǒng)蒙藥與方劑》[9]中記載,多葉棘豆有殺粘、清熱、燥協(xié)日烏素、愈傷、生肌、鎖邁止血、消腫的功效。川貝母為傳統(tǒng)的止咳化痰良藥,相關(guān)報(bào)道[10-12]指出:黏稠的痰會(huì)造成呼吸道阻塞而感染,并刺激呼吸道引起咳嗽,川貝母可降低痰液黏稠度,同時(shí)對(duì)平滑肌有松弛作用,有良好的祛痰作用。甘草為一種使用很廣泛的中草藥,主要功效益氣補(bǔ)中、去痰止咳、解毒、緩急止痛、調(diào)和藥效等[13]。相關(guān)研究[14]指出,服用甘草后,其通過(guò)緩和炎性刺激達(dá)到鎮(zhèn)咳效果,并促進(jìn)支氣管黏膜分泌使痰咳出。石膏為中醫(yī)臨床常用藥,具有清熱瀉火,抗病毒等功效。棘豆止咳散廣泛應(yīng)用于臨床,治療巴達(dá)干、其素偏盛性肺病、哮喘等疾病。綜上所述,棘豆止咳散的傳統(tǒng)應(yīng)用與現(xiàn)代研究結(jié)果有很多的相關(guān)之處和一致性,為后期棘豆止咳散的開(kāi)發(fā)研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果
由于多葉棘豆只有部頒標(biāo)準(zhǔn),未有中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn),研究尚不明確。川貝母在棘豆止咳散中的比例小,指標(biāo)成分含量小,暫時(shí)尚未研究。石膏其主要化學(xué)成分是硫酸鈣,所以本實(shí)驗(yàn)暫不研究。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇了甘草中的甘草苷作為研究對(duì)象。這只是初步研究,筆者團(tuán)隊(duì)接下來(lái)會(huì)進(jìn)一步研究棘豆止咳散中的其他成分,為棘豆止咳散的質(zhì)量控制做出依據(jù)。
本實(shí)驗(yàn)還比較了甲醇-水、乙腈-水的梯度洗脫系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)以乙腈-水為流動(dòng)性,檢測(cè)波長(zhǎng)為237 nm時(shí),被測(cè)組分的分離效果好,分離度符合要求。從表2可以看出,其r2=0.9993,說(shuō)明甘草苷在該范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。從表3~5可以看出,其精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性的RSD值均小于3.0%,其回收率在90.19%~97.87%,建立的方法學(xué)考察指標(biāo)均符合藥典規(guī)定,上述結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)所建立的含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便,可靠,重復(fù)性好,可用于棘豆止咳散的質(zhì)量控制,為該制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)及深層次開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。