γ- 谷胱甘肽環(huán)?；D(zhuǎn)移酶在結(jié)直腸癌中的表達(dá) 及臨床意義

邵曉霞，郗彥鳳，步鵬，杜海燕，馮皓楠，宋鶴，徐菁*

（1 山西醫(yī)科大學(xué)病理教研室，太原030001；2 山西省腫瘤醫(yī)院病理科，太原 030013）

γ-谷胱甘肽環(huán)?；D(zhuǎn)移酶（γ-glutamyl cyclo transferase, GGCT）是γ-谷胱甘肽循環(huán)中的一個(gè)必要酶，參與γ-谷氨酰肽分解為5-代脯氨酸和游離氨基酸的反應(yīng)[1,2]。近年來(lái)，一些研究報(bào)道GGCT 在肺癌、 卵巢癌等多種腫瘤中過(guò)表達(dá)[3,4]，然而，其在結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）組織中的表達(dá)情況及其與增殖的相互關(guān)系尚未闡明[5,6]。本研究利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)GGCT、 cyclin D1、Ki67 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，初步探討GGCT 在CRC 發(fā)生發(fā)展中的作用，為CRC 的臨床診斷及治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 病例資料

收集2014 年1 月至6 月在山西省腫瘤醫(yī)院病理科被明確診斷為結(jié)腸癌或直腸癌的患者229 例，其中癌旁正常組織167 例。所有患者均符合以下病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理診斷確診前未經(jīng)放療、化療、內(nèi)分泌治療等特殊治療；②結(jié)/直腸為腫瘤原發(fā)病灶部位，排除轉(zhuǎn)移癌；③有家族性腺瘤性息肉病等遺傳家族史的患者除外；④具有完整的臨床、病理和生存資料。所有患者隨訪至2019 年6 月，生存指標(biāo)以總生存期（overall survival, OS）為主。本研究通過(guò)山西省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審查。

2 組織芯片

用孔徑2.0mm 的組織芯片蠟塊制備儀制作空白陣列蠟塊；提取229 例CRC 患者石蠟組織和HE 切片，顯微鏡下閱片并標(biāo)記腫瘤細(xì)胞聚集區(qū)；將石蠟組織與HE 切片對(duì)比，用穿刺針在切片標(biāo)記對(duì)應(yīng)的石蠟組織處穿孔，取出組織芯；將組織芯填入組織孔內(nèi)，每例樣本穿2 個(gè)孔，以防穿刺部位偏差或切片、染色過(guò)程中組織脫落；烤塊：將穿好的組織芯片置入56 ℃的烤箱內(nèi)8min，將融時(shí)取出，室溫冷卻，反復(fù)多次，直至組織芯與受體蠟融合，以防切片及染色過(guò)程中組織脫落。

3 免疫組織化學(xué)染色

兔抗人GGCT 多克隆抗體購(gòu)自Abcam 公司，按照1:1200 比例稀釋配置抗體工作液，鼠抗人Ki-67、cyclin D1 單抗為山西省腫瘤醫(yī)院病理科診斷用抗體原液（購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。用于免疫組織化學(xué)的石蠟切片厚度均為3μm。所有免疫組織化學(xué)切片染色均由VENTANB BenchMark（LT/XT）平臺(tái)完成。

4 結(jié)果判讀

GGCT 免疫組織化學(xué)結(jié)果判讀分兩種方法進(jìn)行。方法一，即Hi-score 評(píng)分法： H-score=Σ(pi×i)， pi 為陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)占切片中所有腫瘤細(xì)胞數(shù)的百分比（0-100%），i 為著色強(qiáng)度（無(wú)著色記0 分，淡黃色記1 分，黃色記2 分，棕褐色記3 分）。最終得分在0～300 分之間，0～200 分記為陰性，200～300分記為陽(yáng)性。方法二：對(duì)腫瘤細(xì)胞質(zhì)、胞核染色分別進(jìn)行判讀，按細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞占所有腫瘤細(xì)胞的比例和免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0（0%～4%），1（5%～24%），2（25%～49%），3（50%～74%），4（75%～100%）；免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0（無(wú)著色），1（顯色較淺），2（顯色溫和），3（顯色深）。將得到的兩個(gè)評(píng)分相乘，最終得分在0～12分之間[4]，6～12 分記為陽(yáng)性，低于6 分記為陰性。

Ki-67 免疫組織化學(xué)結(jié)果以細(xì)胞核呈現(xiàn)清晰的棕黃色顆粒為陽(yáng)性，按陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)占所有腫瘤細(xì)胞數(shù)的比例進(jìn)行判讀：＜10%為陰性（-）， 10%～25%為弱陽(yáng)性（+），26%～50%為中度陽(yáng)性（++），＞50%為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。（-）和（+）為陰性，（++）和（+++）為陽(yáng)性。

Cyclin D1 定位于細(xì)胞核，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果以核陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)占所有腫瘤細(xì)胞數(shù)的比例和免疫染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。按比例評(píng)分：0 分（≤5%），1 分（6%～25%），2 分（26%～50%），3 分（51%～75%），4 分（76%～100%）；按免疫染色強(qiáng)度評(píng)分：0 分（無(wú)染色），1 分（淺黃色），2（黃色），3（黃褐色）。將得到的兩個(gè)評(píng)分相乘，最終得分在0～12 分之間。0～3 分記為陰性，4～12 分記為陽(yáng)性[7]。

以上判讀均由病理科兩位具有中級(jí)及以上職稱(chēng)的醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行判讀。最后結(jié)果取兩組數(shù)值的平均數(shù)。

5 隨訪

所有患者隨訪時(shí)間均從其首次病理確診之日起， 2019 年6 月30 日止，中位隨訪時(shí)間59 個(gè)月。所有隨訪均以門(mén)診或電話隨訪的方式進(jìn)行。

6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料用百分率（%）表示，計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)。兩變量之間的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)。采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析。

結(jié) 果

1 病例資料特點(diǎn)

在229 例患者中，男性128 例，女性101 例，年齡23-84 歲，中位年齡63 歲，病變部位位于結(jié)腸的38 例，位于直腸的191 例。采用最新版TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)(2018 年第8 版)。詳細(xì)資料見(jiàn)表2。

2 CRC 與癌旁正常結(jié)直腸組織中GGCT、Ki-67 和cyclin D1 的表達(dá)

2.1 H-score 評(píng)分法

GGCT 在CRC 和癌旁正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為77.7%（178 / 229）和54.5%（91/167），差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.868，P=0.190）。

2.2 腫瘤細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核染色分別判讀結(jié)果

GGCT 在CRC 和癌旁正常組織中胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)率分別為83.4%（191/229）和75.4%（126/167），差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.101，P=0.792）。GGCT在CRC 和癌旁正常組織中胞核陽(yáng)性表達(dá)率分別為36.7%和74.3%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.045）；Ki-67 在CRC 和癌旁正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為77.7%和60.5%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.040）；cyclin D1在CRC和癌旁正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為43.2%和12.0%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.030）（見(jiàn)圖1 和表1）。

圖1. GGCT、Ki-67 和cyclin D1 在癌旁正常組織和CRC 組織中的表達(dá)。紅箭頭，胞核（+）；綠箭頭，胞質(zhì)（+）；標(biāo)尺，50μmFig. 1 Expression of GGCT, Ki-67 and cyclin D1 in adjacent normal tissues and CRC tissues. Red arrow, nucleus (+)； green arrows, cytoplasmic (+)； scale bar, 50μm

表1 GGCT（核）、Ki-67 及cyclin D1 在CRC 和癌旁正常組織中的表達(dá)Tab. 1 The expression of GGCT (nucleus), Ki-67 and cyclin D1 in CRC and adjacent normal tissues

2.3 CRC 組織中GGCT、Ki-67 和cyclin D1 核表達(dá)與臨床病理各參數(shù)之間的關(guān)系

CRC 患者GGCT 在細(xì)胞核的陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期呈負(fù)相關(guān)，與性別、年齡、腫瘤部位、神經(jīng)侵犯及脈管侵犯無(wú)關(guān)。CRC患者Ki-67 陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤大小和TNM 分期呈正相關(guān)，與性別、年齡、腫瘤部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯及脈管侵犯無(wú)關(guān)。CRC 患者cyclin D1 陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)，與腫瘤部位相關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯及TNM 分期呈正相關(guān)，與性別、年齡及神經(jīng)累犯無(wú)關(guān)（表2）。

表2 CRC 組織中GGCT、Ki-67 及cyclin D1 的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系Tab. 2 The expression of GGCT, Ki-67 and cyclin D1 in CRC cell and their relationship with clinicopathological factors

2.4 CRC 組織中GGCT 核表達(dá)與Ki-67 、cyclin D1表達(dá)的相關(guān)性

CRC 組織中GGCT 胞核的表達(dá)與Ki-67 、cyclin D1 的表達(dá)均具有明顯的負(fù)相關(guān)性（r=0.246，P=0.000；r=0.225，P=0.001）（表3），Ki-67 和cyclin D1 的表達(dá)具有明顯的正相關(guān)性（r=0.276，P=0.000）（表4）。

2.5 GGCT 胞核表達(dá)與CRC 患者生存期的關(guān)系

在229 例CRC 患者中，截止2019 年6 月底有完整隨訪資料的210 例，其中死亡45 例，生存165 例。CRC 患者中GGCT 胞核表達(dá)陰性組的生存期低于陽(yáng)性組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.043）（圖2）。

表3 GGCT 和Ki-67、cyclin D1 在CRC 組織中表達(dá)的相關(guān)性分析Tab. 3 The correlation of GGCT and Ki-67, cyclin D1 expression in CRC tissues

表4 Ki-67 和cyclin D1 在CRC 組織中表達(dá)的相關(guān)性分析Tab. 4 The correlation of Ki-67 and cyclin D1 expression in CRC tissues

圖2 GGCT 胞核表達(dá)與CRC 預(yù)后關(guān)系的 Kaplan-Meier 生存曲線分析Fig. 2 Kaplan-Meier survival curve analysis of GGCT expression in nuclei and CRC prognosis

討 論

結(jié)直腸癌是全球常見(jiàn)致命腫瘤之一[8]，近年來(lái)，雖然治療方法取得很大進(jìn)展，但其發(fā)病率、死亡率仍居高不下[9,10]。靶向治療作為一種新興的治療方案，在CRC 的個(gè)體化治療過(guò)程中扮演著越來(lái)越重要的角色。

GGCT 最初作為參與γ-谷胱甘肽合成和降解過(guò)程中的一種酶被發(fā)現(xiàn)，是一個(gè)有188個(gè)氨基酸的小分子蛋白，在多種器官中普遍表達(dá)。其基因定位于第7b 染色體上，由4 個(gè)跨越8kb 的外顯子組成[11]。近年來(lái)，GGCT 被報(bào)道在肺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌和骨肉瘤等多種腫瘤組織中高表達(dá)[4,5,12-17]，但在CRC 中的表達(dá)情況目前尚無(wú)定論。2010 年，Gromove 等[6]通過(guò)凝膠電泳的方法檢測(cè)GGCT 在72%的結(jié)腸癌中高表達(dá)，然而2014年Takemura 等[5]利用免疫在組織化學(xué)技術(shù)卻發(fā)現(xiàn)GGCT 在CRC 和結(jié)直腸正常組織中的表達(dá)水平并未存在差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，GGCT 在結(jié)直腸癌旁正常組織和癌組織的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，且在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)較均勻，與Amano 等的報(bào)道一致[18]。Hscore 評(píng)分法在CRC 和癌旁正常結(jié)直腸組織中未發(fā)現(xiàn)GGCT 的表達(dá)存在明顯差異。但在判讀過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，GGCT 在結(jié)直腸癌旁正常組織和癌組織中定位存在差異。將胞核、胞質(zhì)免疫組化染色結(jié)果分別進(jìn)行判讀發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌旁正常組織中GGCT 呈現(xiàn)出核的高表達(dá)，而癌組織中GGCT 核表達(dá)率顯著低于正常組織；GGCT 在癌旁正常組織和癌組織中胞質(zhì)表達(dá)較胞核表達(dá)均勻，但在癌旁正常組織和癌組織中胞質(zhì)表達(dá)未存在差異。這一結(jié)果提示GGCT 在結(jié)直腸癌旁正常組織和癌組織中的不同定位，可能導(dǎo)致發(fā)揮的功能存在差異。2009 年Azumi 等[11]分析GGCT 的細(xì)胞定位時(shí)，發(fā)現(xiàn)第60-120 位氨基酸殘基的存在是GGCT 表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中所必需的，而該區(qū)域的缺失會(huì)使GGCT 移動(dòng)到細(xì)胞核，盡管這一蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的功能目前并不知曉。本研究發(fā)現(xiàn)GGCT 在細(xì)胞核中表達(dá)，高度提示其可能是一種翻譯后修飾形式或剪接體。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)GGCT在CRC腫瘤細(xì)胞核中的表達(dá)較癌旁正常組織明顯下降，推測(cè)GGCT 翻譯后修飾能力或其剪接體形式的下降存在于CRC 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，并導(dǎo)致GGCT在細(xì)胞內(nèi)原本穩(wěn)定的功能發(fā)生改變，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的形成。

此外，GGCT 也被報(bào)道可能參與了腫瘤細(xì)胞周期的調(diào)控。Lin.Z、Jian Dong[3,19]通過(guò)GGCT敲除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GGCT 可以通過(guò)調(diào)控p21、p27、cyclin E的表達(dá)，在G0/G1 期顯著抑制細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)選取了臨床上常用的標(biāo)記細(xì)胞增殖的兩個(gè)免疫組化指標(biāo)——Ki-67 和cyclin D1（G1/S-特異性周期蛋白-D1）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ki-67 和cyclin D1 在CRC 組織中表達(dá)均明顯增加，這一結(jié)果與先前報(bào)道一致[20,21]。兩變量間相關(guān)性分析結(jié)果顯示，GGCT 癌細(xì)胞核表達(dá)與Ki-67、cyclin D1 存在明顯的負(fù)相關(guān)性，這一結(jié)果提示結(jié)直腸細(xì)胞核中GGCT 的表達(dá)可能參與了細(xì)胞周期調(diào)控，與細(xì)胞增殖有關(guān)，胞核中GGCT 表達(dá)的下降可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖活性的增加。

本研究中CRC 患者cyclin D1 陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)，此結(jié)果與先前部分研究報(bào)道不一[22,23]，可能是判讀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)不一或所用抗體不一所導(dǎo)致。另外，Ki-67 和cyclin D1 在CRC 中表達(dá)顯著增加，且Ki-67 和cyclin D1 之間具有明顯的正相關(guān)性，這一結(jié)果也證實(shí)了細(xì)胞增殖活性增加確實(shí)存在于CRC 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中。我們進(jìn)一步進(jìn)行了CRC組織中GGCT胞核表達(dá)與CRC患者總生存預(yù)后的分析，結(jié)果顯示GGCT 核表達(dá)降低，CRC 患者預(yù)后生存差，進(jìn)一步證實(shí)CRC 組織細(xì)胞核GGCT 表達(dá)的降低，參與到了CRC 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中。

綜上，GGCT 在CRC 和癌旁正常組織中存在部位的差異性表達(dá)主要體現(xiàn)在細(xì)胞核定位上，在CRC中低表達(dá)，癌旁正常組織中高表達(dá)，表明GGCT 在CRC 細(xì)胞核表達(dá)的下降是CRC 發(fā)生發(fā)展的常見(jiàn)事件，核表達(dá)的下降與細(xì)胞增殖活性增加、患者生存預(yù)后有關(guān)，但造成這一現(xiàn)象的具體作用機(jī)制目前尚不清楚，仍需進(jìn)一步的探索。