改良的動脈內(nèi)皮細胞鋪片技術(shù)—醫(yī)學(xué)形態(tài)學(xué)與醫(yī)學(xué)機能學(xué)的實驗教學(xué)融合設(shè)計

王婧婧，李莉，郭曉筍，邴魯軍，馬保華，劉尚明

山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1 病理生理學(xué)教研室 2 醫(yī)學(xué)形態(tài)學(xué)實驗室 3 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，濟南 250012

動脈內(nèi)皮細胞鋪片技術(shù)由Schwartz 等[1]首次建立。相對于動脈橫斷面切片，該技術(shù)將待研究血管縱行剖開，內(nèi)皮面朝上固定在特殊處理玻片上，可以大范圍呈現(xiàn)在體血管內(nèi)皮細胞、進行直觀的形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)合免疫組織化學(xué)、原位雜交等方法，還能對在體動脈內(nèi)皮細胞的損傷程度、細胞因子釋放功能、增殖和凋亡水平等進行定量分析[2-6]，可作為早期觀察動脈血管內(nèi)皮細胞形態(tài)變化及進行多種血管損傷評價的有力手段。但這一實驗技術(shù)步驟繁多、試劑配制復(fù)雜，許多環(huán)節(jié)操作不慎極易導(dǎo)致鋪片失敗，因此需要進行細致的優(yōu)化和改良，才能適應(yīng)實驗教學(xué)的需要。

在當前以崗位勝任力培養(yǎng)為導(dǎo)向的醫(yī)學(xué)教育改革背景下，醫(yī)學(xué)形態(tài)學(xué)與醫(yī)學(xué)機能學(xué)的實驗教學(xué)融合，是醫(yī)學(xué)學(xué)科特性的必然選擇[7]。首先，生物體結(jié)構(gòu)決定功能，功能影響結(jié)構(gòu)，二者協(xié)同統(tǒng)一；其次，機能、形態(tài)實驗序貫教學(xué)，可相對完整地模擬臨床疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸過程中機體系統(tǒng)、組織、器官、乃至細胞（分子）水平的結(jié)構(gòu)與功能改變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)與核心過程。因此，醫(yī)學(xué)形態(tài)學(xué)與醫(yī)學(xué)機能學(xué)的有機融合，不僅是醫(yī)學(xué)相關(guān)課程理論學(xué)習(xí)的整合，也是醫(yī)學(xué)生早期感知、認知臨床疾病較理想的情景與場所，更是早期培養(yǎng)醫(yī)學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題、分析問題、解決問題的臨床思維模式與基本能力的最佳途徑之一。

為了提高實驗?zāi)康男?、可觀察性和可操作性，提高實驗成功率，本研究優(yōu)化和改良了動脈內(nèi)皮細胞鋪片技術(shù)。為了強化學(xué)生對動脈粥樣硬化這一病理過程的全方位認識，培養(yǎng)學(xué)生的綜合和創(chuàng)新能力，本研究設(shè)計增加了機能學(xué)實驗內(nèi)容，學(xué)生分組完成對高脂和普通飲食大鼠的功能、代謝到組織學(xué)變化的觀察和分析。

材料與方法

1 教學(xué)對象

面向山東大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)五年制、本碩和齊魯醫(yī)學(xué)班學(xué)生。學(xué)生自由選課，分為2 個大組，每組分6～9 個實驗組，每個實驗組至少3 名學(xué)生，共14～18 學(xué)時。

2 材料與試劑

SPF 級健康 4 周 齡雄性 SD 大鼠 20 只，體重85～108 g，購自山東大學(xué)實驗動物中心，明膠、多聚甲醛、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、蘇木素染液、伊紅染液等均購自濟南億飛科貿(mào)有限公司。

3 試劑的配制及鋪片制備

由老師實驗前配制完成。

3.1 明膠鋪底片

燒杯內(nèi)加入1000ml 水后加入5g 明膠，玻璃棒輕輕攪拌，低溫加熱至明膠溶解，再加入鉻明礬0.5g溶解， 盡快放入冰水盆內(nèi)，使溶液溫度降至20℃。將洗干凈的載玻片放入該溶液中5～10min，控干后放入37℃烤箱內(nèi)烤干。

3.2 覆蓋明膠玻片

1g 明膠加入20ml 蒸餾水中，在水浴鍋中煮溶解。明膠鋪底片提前半小時放入60℃烤箱，然后將煮好的明膠溶液，用滴管平行均勻的涂在明膠鋪底片上，重復(fù)涂3 次，使液體垂直流下，再將鋪片放平，放入37℃烤箱內(nèi)5h，該片應(yīng)當天使用。

3.3 配制中性緩沖固定液

37%甲醛溶液100ml，4g 磷酸二氫鈉和6.5g 磷酸氫二鈉加至1000ml 蒸餾水中溶解。

3.4 配制4%多聚甲醛溶液

40g 多聚甲醛加入500ml 蒸餾水，用玻璃棒攪動加熱至60～70℃，再加入1～2ml 5mol/L 氫氧化鈉溶液，使溶液清澈，冷卻至室溫、過濾，測量體積，加入等量0.2mol/L pH7.2 的磷酸緩沖液（14g 磷酸氫二鈉，2.7g 磷酸二氫鉀加水至500ml），使pH 值為7.2～7.4。

4 制作動脈粥樣硬化動物模型

開課前8 周由老師制作完成：20 只健康雄性SD 大鼠分別給予高脂飲食（豬油10%，蔗糖20%，蛋黃粉8%，膽鹽1%，蛋氨酸2%，基礎(chǔ)鼠料59%）和正常飲食，自由攝食和飲水的條件下飼養(yǎng)8 周后進行后續(xù)試驗。

5 教學(xué)實施

5.1 第一次課：大鼠血清生化指標測定、主動脈取材與固定

4 學(xué)時，學(xué)生分組完成。大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉（35mg/kg 體重）進行麻醉，心尖取血，離心分離血清，應(yīng)用全自動生化分析儀（日立7600）測定血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平以及谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和堿性磷酸酶（ALP）指標變化，各樣本生化指標測定時均設(shè)2 個平行孔。

大鼠頸總動脈插管，恒壓灌注4%多聚甲醛（pH7.2），持續(xù)10min，然后分離主動脈，置于4%多聚甲醛固定液內(nèi)。

5.2 第二次課：大鼠主動脈內(nèi)皮細胞鋪片制作

4 學(xué)時，學(xué)生分組完成。將大鼠主動脈從固定液中取出并沿縱軸剖開血管，切成1cm 左右動脈段，內(nèi)皮面朝上用鋼針固定于特氟龍板上（如果做后續(xù)免疫組織化學(xué)和原位雜交染色，可從這步開始一直到DAB 顯色）。

35%、50%、75%、85%、95%、100%、100%乙醇脫水各5min， 將2%火棉膠（1ml 乙醚， 1ml乙醇和1.5ml 火棉膠配制）滴于動脈內(nèi)皮上，將標本內(nèi)膜面朝下壓貼在火棉膠片上，室溫放置30min。

將粘上大鼠主動脈的火棉膠片放入35%乙醇內(nèi)充分浸潤，30min 后拿出并剝離動脈外膜和中膜，接著滴入溫熱的10%明膠覆蓋血管內(nèi)膜。放濕盒內(nèi)室溫1h，甩掉過多的明膠后，將內(nèi)膜面朝下反轉(zhuǎn)壓貼在明膠涂片上，然后加壓固定好，置入中性緩沖固定液中。

5.3 第三次課：大鼠主動脈內(nèi)皮細胞鋪片的HE 染色

4 學(xué)時，學(xué)生分組完成。大鼠主動脈內(nèi)皮細胞鋪片經(jīng)酒精脫水35%→50%→70%→95%→100% →100%各5 分鐘，放入1:1 乙醇/乙醚溶液中15 分鐘×3 次（溶解火棉膠，每次都需要新配），便得到一層腔面朝上的內(nèi)皮細胞鋪片。

經(jīng) 水 化100%→100%→95%→95%→35% 各5 分鐘，4℃蒸餾水沖洗3 分鐘×5 次。蘇木素染色3分鐘，流水沖洗5 分鐘。經(jīng)70% → 80% → 90% → 95% → 100% → 100% → 二甲苯Ⅰ → 二甲苯Ⅱ 脫水透明后，中性樹膠固定封片。

5.4 第四次課：整理數(shù)據(jù)，統(tǒng)計學(xué)分析

2～4 學(xué)時，課上集中討論，課下完成數(shù)據(jù)分析。匯集多班次、多組別的實驗結(jié)果，提供給每組學(xué)生明確的數(shù)據(jù)，共同進行統(tǒng)計學(xué)分析。讓學(xué)生在實踐中學(xué)習(xí)分工合作、從而共同達到學(xué)習(xí)目標。

5.5 選做

聯(lián)合免疫組織化學(xué)技術(shù)進一步觀察血管內(nèi)皮細胞損傷情況。實驗前與同學(xué)一起閱讀相關(guān)文獻[8]，血管內(nèi)皮細胞受損后合成和釋放內(nèi)皮素-1（Endothelin-1, ET-1）增多，而ET-1 又能引起血管收縮、加重內(nèi)皮細胞損傷和促進平滑肌細胞增殖, 從而參與心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，檢測血管內(nèi)皮細胞ET-1 的表達情況可以說明其損傷程度。學(xué)生根據(jù)自己實際情況決定是否繼續(xù)進行免疫組織化學(xué)實驗，由教師提前購置試劑，進行下一步染色。

結(jié) 果

1 實驗各組大鼠體重、血脂和肝功能代謝指標的變化

收集所有組數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS 行單因素方差分析和t檢驗。與正常飼料喂養(yǎng)組大鼠相比，高脂飼料組大鼠體重增加不明顯，但血清TC、TG 和LDL-C 明顯升高， HDL-C 明顯降低，肝代謝指標AST、ALT和ALP 水平明顯增高（表1）。

表1 大鼠增重、血脂和血清ALT, AST 和ALP 變化Tab. 1 Comparison of gaining weight, serum lipids, ALT, AST and ALP levels in 2 groups

2 實驗各組動脈內(nèi)皮細胞鋪片結(jié)果

HE 染色顯示，正常飼料組大鼠內(nèi)皮細胞核呈橢圓形，核輪廓清晰，沿長軸排列，分布均勻；高脂飼料組動物內(nèi)皮細胞排列不規(guī)則，細胞密度增加。結(jié)合免疫組織化學(xué)方法，光鏡下計數(shù)每組標本ET-1 陽性細胞數(shù)，并應(yīng)用SPSS 行單因素方差分析和t檢驗顯示，正常飼料組大鼠ET-1 陽性細胞數(shù)量較少，高脂飼料組 大鼠ET-1 陽性細胞數(shù)量明顯增多（0.01＜P＜0.05）（圖1）。

圖1 動脈內(nèi)皮細胞鋪片HE 染色聯(lián)合免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察內(nèi)皮細胞的形態(tài)學(xué)變化。A，正常組大鼠內(nèi)皮細胞鋪片（HE 染色）； B，高脂組大鼠內(nèi)皮細胞鋪片（HE 染色）； C，正常組大鼠內(nèi)皮細胞鋪片（ET-1 免疫組織化學(xué)染色）；D，高脂組大鼠內(nèi)皮細胞鋪片（ET-1 免疫組織化學(xué)染色）；比例尺 25μmFig.1 The morphological changes of endothelial cells by artery endothelium preparation combined with HE and immunohistochemical staining. A, control group (HE staining)； B, hyperlipidic group (HE staining)； C, control group (ET-1 staining)； D, hyperlipidic group (ET-1 staining)； scale bar, 25μm

討 論

血管內(nèi)皮細胞的功能變化是血管損傷機制的始動環(huán)節(jié)[9]，體外及在體研究均需借助一個方法清晰地顯示血管內(nèi)皮細胞形態(tài)，尤其是在體模型。簡單的血管橫斷面病理切片難以觀察一層血管內(nèi)皮細胞的變化，更無法進行定量研究。血管內(nèi)皮細胞鋪片技術(shù)的建立，使大范圍地呈現(xiàn)在體血管內(nèi)皮細胞成為可能，并可穩(wěn)定地用于免疫組織化學(xué)、原位雜交等研究方法。傳統(tǒng)的動脈內(nèi)皮細胞鋪片技術(shù)制作步驟繁多、流程復(fù)雜，許多環(huán)節(jié)操作不慎極易導(dǎo)致鋪片失敗，并很難在有限的實驗課時內(nèi)完成，極大的限制了此實驗項目在實驗教學(xué)中的推廣應(yīng)用。

我們通過不斷的實驗摸索，對操作環(huán)節(jié)進行改進，如玻片包被、血管組織脫水及烤片等環(huán)節(jié)，使大鼠血管內(nèi)皮細胞鋪片的制備質(zhì)量明顯提高：技術(shù)改良后的大鼠血管內(nèi)皮細胞鋪片，內(nèi)皮細胞分布均勻、背景干凈、無過多著色。本實驗結(jié)果還證明，經(jīng)過細致充分的實驗準備后，學(xué)生可以在既定時間內(nèi)完成實驗內(nèi)容，達到預(yù)期學(xué)習(xí)目標提高學(xué)生的實踐水平。

此外，為適應(yīng)新時期醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)改革，我們設(shè)計、增加了機能學(xué)實驗內(nèi)容，將高脂飼養(yǎng)和普通飲食的SD 大鼠先從功能和代謝方面進行分析比較，再利用改良后的動脈內(nèi)皮鋪片技術(shù)對組織學(xué)進行形態(tài)學(xué)觀察，將機能、形態(tài)學(xué)與疾病的發(fā)生發(fā)展有機地融為一體。有助于建立學(xué)生的醫(yī)學(xué)整體觀和臨床思維，可作為一門新的醫(yī)學(xué)形態(tài)學(xué)實驗教學(xué)內(nèi)容。